论文摘要
目的:探讨慢病毒介导的siRNA沉默DREAM在坐骨神经慢性压迫（chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI）大鼠疼痛基因治疗中的应用;观察脊髓背角星形胶质细胞（astrocyte,Ast）活性在DREAM基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）前后的变化;观察pCREB在脊髓背角的总体表达和Ast内的含量变化。进一步了解脊髓背角Ast及pCREB在DREAMsiRNA介导的CCI大鼠疼痛基因治疗中的作用。方法:选择健康雄性SD大鼠24只,随机分为四组（n=6）:即RNAi组、NS组、blank vector组和sham组,造模前1d测定基础痛阈（包括PWTL和PWMT）,并于CCI后第7-14d（即T7-T14）,每天测定1次。于CCI后第8天（T8）开始经微导管分别注入pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒（1×109 IU/ml）5μl+NS 5μl或blank vector 5μl+NS5μl或NS10μl,连续注射7d。于CCI后第15d,取L4-5脊髓节段,石蜡包埋、切片,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）、脊髓背角胶质原纤维酸性蛋白（green fluorescent protein,GFAP）、脊髓背角磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白（phosphorylation of cyclic AMP responseelement binding protein,pCREB）的表达。结果:1.大鼠痛阈的变化:各组基础痛阈比较无统计学意义（p＞0.05）;PWTL:左后肢PWTL:RNAi组的T7-T10及T12、sham组的T7-T10、blank vector组及NS组的T7-T14均低于基础痛阈（P＜0.05或P＜0.01）;RNAi组的T10、T11、T13及T14均高于该组T7（P＜0.01）;blank vector组及NS组的T9-T14均低于同组T7水平（P＜0.05或P＜0.01）;blank vector组及NS组的T13和T14分别低于sham组相应时点的阈值（P＜0.05）;而RNAi组的T11、T13、T14则分别高于blankvector组和NS组相应时点的阈值（P＜0.05）;右后肢PWTL:不同时间点各组间比较,差异无统计学意义（p＞0.05）。PWMT:左后肢PWMT:各组T7-T14均低于基础痛阈（P＜0.05或P＜0.01）;RNAi组的T8（P＜0.05）、blank vector组和NS组的T8、T12-T14均低于sham组相应时点的阈值（P＜0.05或P＜0.01）;RNAi组的T14高于sham组（P＜0.01）;RNAi组的T12-T14分别高于blank vector组和NS组的相应时点的阈值（P＜0.05或P＜0.01）;右后肢PWMT:不同时间点各组间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。2.脊髓背角GFP表达:CCI后14d时,RNAi组脊髓背角神经细胞中GFP表达阳性,blank vector组无GFP的表达,与其余两组相同。3.脊髓背角GFAP平均荧光强度:blank vector组和NS组最高,且两者比较无统计学意义（P＞0.05）;RNAi组与sham组相似（P＞0.05）,且均低于以上两组（P＜0.01）。4.脊髓背角pCREB平均荧光强度:RNAi组CCI后14d时脊髓背角pCREB平均荧光强度明显弱于blank vector组和NS组（P＜0.01）,但强于sham组（P＜0.05）。5.脊髓背角Ast内pCREB平均荧光强度:RNAi组CCI后14d时脊髓背角Ast内pCREB平均荧光强度明显弱于blank vector组和NS组（P＜0.01）,但与sham组无差异（P＞0.05）。结论:1.连续鞘内注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒可以明显改善CCI大鼠的痛行为。2.DREAM基因下调可明显抑制外周神经伤害性刺激诱发的脊髓背角Ast的活化。3.DREAM基因下调可显著抑制pCREB在脊髓背角的总体表达和Ast内的表达。4.脊髓背角Ast的活性降低和脊髓背角pCREB的低表达可能在DREAM基因沉默治疗CCI大鼠疼痛中发挥重要作用。
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