大豆转化体系的构建及转化植株的功能分析

论文摘要

大豆的遗传转化是大豆基因功能分析的关键一步。近年来国内外已有不少实验室对大豆转化作了研究。本文目的在于对使用相同大豆品种不同转化方法进行系统比较。首先，对大豆遗传转化方法中的花器官注射法、超声波处理法、子叶节转化法、半种转化法和生长点转化法进行比较研究，在子叶节转化法中，我们对大豆不同品种再生率做了比较，找到再生率较好的品种垦农18；另外我们对其中的生长点转化法进行大规模实验，结果表明，生长点转化法可获得单批最好转化率0.31％，所有批次总体转化率为0.1％，子叶节转化法的单批最好转化率为0.31％，总的转化率为0.0008％，半种法单批最好转化率为0.2％，总的转化率为0.0026％，其它两种方法未获得转化植株，生长点转化法具有易操作、低污染、插入的拷贝数低等优点，重要的是不需进行组织培养，减少了体细胞突变对转基因植株表型的干扰，最重要的该方法不受品种再生难易的限制。因此，认为该方法是一较优的大豆非组织转化法。与此同时，我们也对转基因植株筛选方法进行系统性比较，以大豆垦农18为研究材料，采用浸种法、根吸法、叶片涂抹法和喷洒法，筛选抗glufosinate再生植株，结果表明不同方法间筛选结果差距明显，浸种法对种子出苗率有影响，操作复杂；根吸法受土壤条件影响较大，土壤中有机质含量和土壤含水量均影响实验结果，重复性较差；叶片涂抹法受叶龄影响大，费工费时；而叶片喷洒法筛选结果可靠，重复性好，操作简单，省工省时。叶片喷洒法适宜的浓度为1:200稀释glufosinate（113.3mg/ml）；该筛选法是四种筛选方法中最优的一种。对获得的大豆开花相关基因的抗glufosinate大豆植株进行分子检测，PCR、Southern blot、RT-PCR和GFP定位，表明所获得的10株抗性植株均为转化植株，且后代的抗与不抗glufosinate的分离比基本符合孟德尔遗传规律。对开花时间测定表明，大豆开花基因CO、RGA1和MAF RNAi，在长日照条件下（16/8）与野生型垦农18相比晚开花；GAL2基因在大豆中过表达后，在长日下为晚花表型。拟南芥基因Cry1-N563转化大豆后开花时间与野生型无明显差异，但植株粗壮，稍矮化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物基因转化的受体系统
• 1.1.1 原生质体系统
• 1.1.2 愈伤组织受体系统
• 1.1.3 种质系统
• 1.1.4 胚状体受体系统
• 1.1.5 直接分化芽受体系统
• 1.2 植物基因转化载体
• 1.3 转化方法及其在大豆上的应用
• 1.3.1 基因枪法
• 1.3.2 电激法
• 1.3.3 聚乙二醇法
• 1.3.4 显微注射法
• 1.3.5 超声波辅助农杆菌转化方法
• 1.3.6 萌发种子注射法
• 1.3.7 花粉管通道法
• 1.3.8 农杆菌介导法
• 1.4 问题与展望
• 第二章 大豆转化体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 花器官转化法
• 2.2.2 超声波转化法
• 2.2.3 子叶节转化法
• 2.2.4 半种转化法
• 2.2.5 生长点转化法
• 2.3 小结
• 第三章 再生植株抗glufosinate的筛选方法及筛选浓度的确定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 浸种法
• 3.2.2 根吸法
• 3.2.3 叶片涂抹法
• 3.2.4 叶片喷洒法
• 3.3 小结
• 第四章 再生植株的分子检测
• 4.1 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 转化植株的表现型及遗传分析
• 4.2.2 转化植株分子生物学和细胞学证据
• 4.2.2.1 PCR检测
• 4.2.2.2 Southern blot
• 4.2.2.3 GFP观察
• 4.2.2.4 RT-PCR
• 4.2.2.5 Western blot
• 4.3 小结
• 第五章 问题与讨论
• 5.1 关于转化率
• 5.2 关于转化问题
• 5.3 关于转化植株抗性筛选
• 第六章 结论
• 第七章 本研究的理论及实际意义
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 博士生期间发表的学术论文、专著、重要科研成果
• 博士后期间发表的学术论文、专著、重要科研成果
• 永久通讯方式