论文摘要
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）泌尿生殖道感染是世界范围内严重危害公众健康的一种细菌感染性疾病。Ct的生殖道感染常引起女性盆腔炎、宫颈炎等,常引起男性尿道炎、睾丸炎和前列腺炎等。由于无症状性衣原体感染的普遍存在,致使该疾病不易被发现而得不到及时治疗,导致Ct在宿主体内持续存在并引起不孕、异位妊娠等严重并发症,故阐明Ct致病机制,寻找免疫优势抗原基因研制疫苗,是预防、控制Ct感染的关键。质粒蛋白与衣原体毒力直接相关,O’Connell等报道质粒缺失Ct不引起生殖道的病变,说明质粒蛋白在衣原体致病中发挥重要作用。包涵体（Inclusion,InC）膜蛋白能介导衣原体与宿主细胞的相互作用,鉴定新的InC蛋白可为衣原体与宿主细胞相互作用机制提供重要信息。因此,为阐明Ct质粒蛋白致病机理,寻找新的膜定位分子以及研制有效的Ct疫苗,我们进行了以下研究:一、沙眼衣原体质粒蛋白定位与生物学特性分析及质粒蛋白pORF5核酸疫苗免疫效果研究研究目的构建Ct 8种质粒蛋白原核表达载体pGEX-6p-pCTs,制备单克隆抗体和多克隆抗体,旨在分析8种质粒蛋白在衣原体感染细胞中的定位,探讨衣原体致病机理;构建真核表达载体pcDNA3.1-pORF5,与免疫佐剂pcDNA3.1-IL-12以鼻粘膜方式联合免疫小鼠,建立小鼠生殖道感染模型,观察生殖道局部病理变化以及其诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制新型的Ct核酸疫苗提供实验依据。研究方法1、从GenBank中查询Ct质粒蛋白基因序列,设计并合成8对特异性引物,PCR扩增8个质粒蛋白全长基因片段,构建pGEX-6p-pCTs原核表达重组体;重组体经IPTG诱导在E.coliXL1Blue中表达融合蛋白GST-pCTs,Glutathione Sepharose 4B Beads亲和层析纯化融合蛋白;纯化的融合蛋白免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体;间接免疫荧光试验检测8种质粒蛋白在感染细胞中的定位及pORF5在感染细胞中的表达模式及存在方式;ELISA分析比较8种质粒蛋白的免疫原性及pORF5质粒蛋白体外刺激Raw264.7细胞产生细胞因子水平。2、将pORF5基因亚克隆至真核表达载体构建pcDNA3.1-pORF5重组体,以BALB/c为免疫动物,采用鼻粘膜免疫方式进行免疫。将小鼠分为pcDNA3.1空质粒对照组、PBS对照组、pcDNA3.1-IL12对照组、pcDNA3.1-pORF5单独免疫组、pcDNA3.1-pORF5与pcDNA3.1-IL12联合免疫组;ELISA检测血清和生殖道局部抗体滴度和细胞因子产生水平;MTT法检测脾淋巴细胞特异性增殖反应;建立Ct鼠肺炎型（MoPn）生殖道感染模型,检测衣原体生殖道攻击后其清除情况、体重变化及局部组织病理学变化,综合分析pORF5联合疫苗免疫保护效果。研究结果1、以D型Ct基因组为模板PCR扩增得到了8种质粒蛋白全长基因片段;构建了质粒蛋白原核表达系统pGEX-6p-pCTs,原核表达重组体均在E.coli中表达出相应的融合蛋白,各融合蛋白主要以可溶性的形式存在;采用Glutathione Sepharose 4B Beads亲和层析纯化得到了高纯度的8种质粒融合蛋白;制备了8种融合蛋白的多克隆抗体,各抗体效价均在1:6400以上;获得了17株特异性且抗体分泌稳定的杂交瘤细胞株。2、8种质粒蛋白能与Ct生殖道感染患者血清发生免疫反应,但反应强度、反应频率不同,在所检测的15个病人血清中,pORF5识别所有病人的血清,且免疫反应最强;N端缺失66氨基酸的F6片段在与患者血清ELISA反应中,免疫反应强度与pORF5全长基本相似。3、pORF5在感染细胞中的分布模式与CPAF一致,分布于宿主细胞胞浆中,但也少量分布在EB、RB上,其余7种质粒蛋白与MOMP的分布模式相同,分布于衣原体菌体上;pORF5在Ct感染后12h就有表达,常以单体、三聚体、多聚体的形式存在;胞浆表达pORF5不影响其后Ct的感染（p>0.05）。4、pORF5蛋白诱导Raw264.7细胞产生TNF-α、IL-6、IL-8的水平随着pORF5浓度的升高而增多,当pORF5蛋白的浓度升为10μg/mL时,TNF-α、IL-6、IL-8的产生量分别为1658.87±255.34pg/mL、7511.55±720.13 pg/mL、4643.20±412.24 pg/mL。5、pORF5单独免疫组、pORF5与IL-12联合免疫组血清抗体随着接种次数的增多,滴度逐渐升高。第一次免疫后第3w部分小鼠血清中可明显检测到特异性抗体,第6w特异性抗体升高显著,血清抗体持续升高,直至第9w抗体产生水平基本稳定,联合免疫组血清抗体总量及IgG2a抗体升高显著,对照组的抗体未出现明显变化;同时,pORF5联合免疫组生殖道局部粘膜抗体显著高于单独免疫组。5组中以联合免疫组IFN-γ产生水平最高,淋巴细胞增殖反应最强。6、pORF5单独免疫组、pORF5与IL-12联合免疫组MoPn感染后体重下降较慢,恢复较快,分别在接种后第15d、12d体重恢复正常,3组对照组在接种MoPn后第21天体重恢复正常。pORF5单独组、pORF5与IL-12联合免疫组清除Ct的速度较早,分别在接种MoPn后第24d、18d完全清除,而对照组在接种MoPn后第30d完全清除。7、3组对照组小鼠输卵管壶腹部、峡部肿胀,管壁血管扩张充血,管腔内充满透明液体,输卵管单侧或双侧积水;免疫组化结果显示粘膜柱状上皮细胞成矮柱状,顶部纤毛显著减少或消失,浆膜层毛细血管扩张,大量淋巴细胞、浆细胞浸润;pORF5单独免疫组出现输卵管管壁增厚,炎性细胞浸润,联合免疫组病理改变最轻;空质粒组,IL-12组、PBS组小鼠炎症积分分别为3.0±0.4、2.6±0.4、2.4±0.3明显高于pORF5单独免疫（1.5±0.3）、pORF5与IL-12联合免疫小鼠（0.8±0.2）。结论1、成功地构建了8种质粒蛋白pGEX-6p-pCTs原核表达载体,并均在E.coli XL1Blue中表达出相应的融合蛋白;成功地制备了17株分泌质粒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,所分泌的单克隆抗体具有特异性。2、8种质粒融合蛋白具有较好的免疫原性和免疫反应性。3、在自然感染状态下,Ct 8种质粒蛋白基因均被激活产生内源性靶蛋白,其中,pORF5免疫原性最强;pORF5为构象依赖性抗原;在天然状态下以单体、三聚体、多聚体等多种形式存在宿主细胞中。4、首次证实pORF5为一种分泌性蛋白,这是继CPAF以来迄今所发现的衣原体第二种分泌性蛋白,而其它7种蛋白均位于衣原体菌体上。5、pORF5能刺激RAW264.7细胞产生TNF-α、IL-6、IL-8等前炎症细胞因子,并具有剂量依赖性。6、首次将pORF5核酸疫苗与IL-12联合免疫小鼠,该联合疫苗能刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,减少输卵管炎性病理改变,显著改变衣原体感染的正常进程,发挥了免疫保护作用。二、沙眼衣原体预测的包涵体膜蛋白定位及特性研究研究目的构建50种预测的Ct包涵体膜（InC）蛋白基因原核表达载体pGEX-6p-InCs,制备多克隆抗体,分析50种预测的InC蛋白在衣原体感染细胞中的定位及生物学特性,为阐明Ct致病机理提供实验依据。研究方法1、从GenBank中查询预测的Ct InC基因序列,设计并合成50对特异性引物;PCR扩增50个膜蛋白基因片段,构建pGEX-6p-InCs原核表达重组体,重组体经IPTG诱导在E.coli XL1Blue中表达融合蛋白GST-InCs;Glutathione Sepharose 4B Beads亲和层析纯化融合蛋白,Western-blot分析鉴定表达产物。2、纯化的融合蛋白与弗氏佐剂充分乳化后,腹腔免疫3～6周龄的BALB/c鼠,制备多克隆抗体,ELISA鉴定50种预测的InC免疫原性;间接免疫荧光实验分析预测的膜蛋白在感染细胞中的分布;同时,检测Ct在自然感染状态下,InCs的表达情况及机体针对InC蛋白所产生抗体滴度水平。3、将免疫优势InC基因分成N、C片段,重新克隆构建pGEX-6p-InC/N重组体;所获得的片段分别在E.coli XL1Blue诱导表达GST融合蛋白;Western blot鉴定其免疫原性部位,确定免疫优势表位。4、将50种预测的膜蛋白基因克隆到pDSRed-C1真核表达载体中,构建真核表达载体重组体pDSRed-C1-InCs,重组体转染Hela细胞表达RFP融合蛋白,该RFP融合蛋白用于检测小鼠产生的抗融合蛋白抗体的特异性及分析胞浆表达的RFP-InCs蛋白对衣原体感染的影响。研究结果1、成功地构建了pGEX-6p-InCs原核表达载体,并均在E.coliXL1Blue中表达出相应的重组融合蛋白;Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化得到了较高纯度的融合蛋白;重组融合蛋白具有较强的免疫原性,能刺激小鼠产生较高滴度的抗体。2、成功地构建了pDSRed-C1-InCs真核表达载体,各基因均在HeLa细胞胞浆部位表达靶蛋白;胞浆表达CT119能显著抑制Ct感染率,在转染阳性的HeLa细胞中衣原体的感染率为29.3±9.5%,而在转染阴性的HeLa细胞中衣原体的感染率为64.1±15.4%。而其它49种预测的InC蛋白不影响衣原体的感染率（P>0.05）。3、CT089、CT115、CT116、CT118、CT119、CT147、CT223、CT225、CT226、CT228、CT229、CT442、CT529、CT618、CT813等15种包涵体蛋白与病人血清发生较强的免疫反应,为免疫优势抗原。进一步分析15种包涵体蛋白的免疫原性部位,发现除了CT223,CT529、CT618抗原表位定位于N端外,其余InC蛋白的抗原表位定位于C端。4、CT225、CT228、CT358、CT440分布模式与CT119相似,定位于包涵体膜上,为InC蛋白;CT058、CT192、CT195、CT383、CT484、CT565、CT850分布模式与MOMP、HSP60相似,为衣原体菌体蛋白。结论1、首次证实CT225、CT228、CT358、CT440为包涵体膜蛋白,CT058、CT192、CT195、CT383、CT484、CT565、CT850为衣原体菌体蛋白。2、多数InC蛋白具有较强的免疫原性,可作为疫苗的侯选抗原。3、InC蛋白的免疫原性主要定位于C端。4、胞浆表达的RFP融合蛋白,除了CT119外,其它49种预测InC蛋白不影响衣原体的感染。
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