Ⅰ 1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸合酶催化机理的初步探索； Ⅱ 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖合成的研究

论文摘要

甲基赤藓糖醇4-磷酸途径（2-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway, MEP pathway）是一条萜类化合物的生物合成途径。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate Synthase,DXS）是MEP途径中的第一个关键酶,它在硫胺素焦磷酸（ThPP, VB1）的帮助下催化丙酮酸与D-甘油醛-3-磷酸（D-Glyceraldehyde 3-phosphate, D-GAP）发生缩合反应形成MEP途径中的第一个重要中间体1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate, DXP）; DXS还是某些细菌中合成ThPP和磷酸吡哆醇（VB6）的关键酶。DXP还原异构化酶（1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, DXR）是MEP途径中的重要限速酶,也是筛选抗菌素和抗疟药物的一个重要靶标,目前对它的研究是该领域内的一个热点。作为DXR酶的天然底物,DXP对于研究DXR的催化机理和以DXR酶为靶标的抗菌素和抗疟药物的筛选是必需的。因此,对DXP合成方法学的研究也成为了一个热点。DXP的脱磷酸产物1-脱氧-D-木酮糖（1-Deoxy-D-xylulose,DX）虽然不是MEP途径中的直接中间体,但由于它可被植物及微生物体内的D-戊糖激酶（D-xylulokinsae）磷酸化形成DXP,因此它被看作是该途径中的一个潜在中间体。目前DXP/DX的合成方法已有一些报道,但化学法合成DXP/DX过程复杂,大多数方法的产率很低,在5%-25%之间。而已有的酶法合成DXP/DX的方法简单,但是底物昂贵且稳定性差。本研究建立了一种新的以廉价、稳定、易得化合物为原料合成DXP以及DX的方法,同时还初步探讨了了DXS在催化DXP合成过程中的作用机理。首先,本研究通过对工程菌种E. coli BL21（DE3）-DXS （EcDXS）和Rhodobacter capsulatus BL21（DE3）-DXS （RcDXS）扩大培养并大量诱导表达,并对表达得到的EcDXS和RcDXS进行亲和层析纯化、凝胶排阻层析纯化,得到了纯的EcDXS和RcDXS。利用这些纯的RcDXS和EcDXS,我们对DXS在催化DXP合成过程中的催化机理进行初步探讨其次,我们根据文献报导的方法合成了DX,并成功摸索了DX的纯化方法。还建立并优化了一种新的化学法-酶法合成DXP/DX的方法,该方法包括以下步骤：1,R-glycidol在磷酸化试剂的作用下发生开环形成L-3-磷酸甘油；2,L-3-磷酸甘油在过氧化脱氢酶的作用下被磷酸甘油氧化酶氧化成磷酸二羟丙酮；3,磷酸二羟丙酮和丙酮酸钠在DXS以及其他物质的作用下生成DXP；4,DXP经过碱性磷酸酶酶切得到DX。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语表
• 第一章 绪论
• 1.1 萜类化合物的简介
• 1.1.1 萜类化合物的定义及分类
• 1.1.2 萜类化合物的生理功能
• 1.2 萜类化合物的生源途径
• 1.2.1 萜类化合物的两条生物合成途径
• 1.2.2 MVA途径
• 1.2.3 MEP途径
• 1.2.4 两条生物合成途径的关系
• 1.3 MEP途径关键酶的研究进展
• 1.3.1 DXS
• 1.3.2 DXR
• 1.4 DX/DXP合成方法的研究进展
• 1.4.1 化学法制备DX/DXP
• 1.4.2 酶法合成DX/DXP
• 第二章 DXS的诱导表达、纯化以及酶机理探究
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要溶液配方
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组蛋白RcDXS、EcDXS的大量诱导表达
• 2.2.2 SDS-PAGE电泳检测诱导表达结果
• 2.2.3 重组蛋白DXS的亲和层析纯化
• 2.2.4 DXS蛋白浓度的测定
• 2.2.5 重组蛋白DXS的浓缩及保存
• 2.2.6 凝胶排阻层析法二次纯化重组蛋白DXS
• 2.2.7 二次纯化后DXS蛋白浓度测定
• 2.2.8 重组DXS蛋白催化机理研究
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 重组蛋白DXS的诱导表达结果
• 2.3.2 重组蛋白DXS的亲和层析纯化结果
• 2.3.3 Bradford法测定Ni-NTA纯化的DXS蛋白浓度结果
• 2.3.4 凝胶排阻层析法对DXS的二次纯化结果
• 2.3.5 Bradford法测定二次纯化后的DXS蛋白浓度结果
• 2.3.6 D-GAP鉴定结果
• 2.3.7 纸色谱法检测DXP的结果
• 2.3.8 LC-MS法检测DXP的结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 DX/DXP合成方法的研究
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 DX参照品的合成
• 3.2.2 以D-甘油醛为底物合成DX
• 3.2.3 薄层色谱检测DX
• 3.2.4 DX的纯化
• 3.2.5 DX的鉴定
• 3.2.6 化学法-酶法合成DXP
• 3.2.7 化学法-酶法合成DXP方法的建立
• 3.2.8 化学法-酶法合成DXP反应监测-HPLC方法的建立
• 3.2.9 HPLC法检测反应产物
• 3.2.10 化学法-酶法合成DXP条件的优化
• 3.2.11 化学法-酶法合成DXP方法的确立
• 3.2.12 纸色谱检测DXP
• 3.2.13 DXP的纯化及鉴定
• 3.2.14 化学法-酶法合成DX
• 3.2.15 化学法-酶法合成DX的纯化及鉴定
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 薄层色谱检测DX结果
• 3.3.2 DX的纯化结果
• 3.3.3 DX的氢谱鉴定结果
• 3.3.4 DX标准品和反应产物的HPLC检测结果
• 3.3.5 L-GPO用量的优化结果
• 3.3.6 catalase用量的优化结果
• 3.3.7 pH条件的优化结果
• 3.3.8 温度条件实验的结果
• 3.3.9 磷酸盐的优化结果
• 2HPO₄和R-glycidol比例的优化'>3.3.10 底物Na₂HPO₄和R-glycidol比例的优化
• 3.3.11 纸色谱检测DXP结果
• 3.3.12 DXP纯化和鉴定结果
• 3.3.13 化学法-酶法合成DX的鉴定结果
• 3.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢