一氧化氮对金黄色葡萄球菌生物膜影响的研究

论文摘要

一氧化氮（nitric oxide,NO）是生物体内重要的活性分子。NO参与了生物体内细胞的分化和凋亡、血管松弛、神经传递、免疫防御反应以及种子萌发、下胚轴伸长、叶扩展、根生长等许多重要生理过程,被认为是多功能的第二信使。NO在动物体和高等植物中的研究早已受到广泛的重视,但是NO在细菌中,尤其是在细菌形成的多细胞结构—细菌生物膜（biofilm）中的作用却极少有人研究。细菌生物膜是由细菌和其分泌的胞外基质在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构,是细菌产生抗生素耐药和逃避机体免疫系统攻击的主要原因。金黄色葡萄球菌（S. aureus）是院内感染的重要病原体之一,其致病机理与其生物膜的生成密切相关。本论文旨在研究NO对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响,为进一步研究NO在生物膜中的作用和机制奠定了基础。首先,利用实时荧光定量PCR检测了S. aureus生物膜和浮游细菌中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）基因nos的mRNA表达水平,结果表明生物膜中nos的表达量明显高于浮游菌,表明NO可能对生物膜的形成具有重要作用。为了检测NO对生物膜的影响,通过外源加入NO供体SNP和NO清除剂PTIO观察细菌生物膜的变化。结果表明SNP能够明显促进S. aureus生物膜的生长,而加入NO清除剂PTIO后能够抑制SNP引起的生物膜的增加。为了进一步研究NO对生物膜的影响,利用同源重组方法构建了S. aureus nos基因缺失突变株。在突变株的构建过程中,我们发现由于S. aureus细胞壁厚而致密而且穿梭重组质粒较大,使用目前的常规转化方法无法导入外源性DNA,限制了遗传操作的进行。为了提高转化效率,我们利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶或Triton X-100在电击转化前对细菌进行预处理,使转化效率显著提高,最高达到1.7×103cfu/μg DNA,从而建立了一种简便、高效的转化方法。同源重组载体pMADΔnos的构建是将PCR获得的nos基因上下游同源序列和壮观霉素抗性基因连入穿梭载体pMAD。pMADΔnos载体首先转入S. aureus RN4220,经修饰后转入S. aureus RN6390,利用温度敏感性和抗生素抗性筛选同源重组体,成功构建了S. aureus RN6390 nos基因缺失突变株。生物膜形成实验表明nos缺失突变株的生物膜形成能力明显减弱,其生物膜的量比野生型减少了30%以上;最低生物膜消除浓度（MBEC）试验表明突变株生物膜对抗生素的敏感性提高为野生型的两倍。综上所述,本论文建立了一种简便高效的S. aureus外源DNA转化方法,并利用同源重组技术构建了S. aureus的nos基因缺失突变株。研究结果证明,外源NO促进了S. aureus生物膜的生长,而nos基因的缺失可以抑制S. aureus生物膜的生长并增强生物膜对抗生素的敏感性。本论文揭示了NO对金黄色葡萄球菌生物膜的作用,为深入研究NO在细菌生物膜形成过程中的作用和机制提供了实验基础和理论依据,同时,为细菌生物膜形成的调节机制和细菌生物膜相关感染的预防和治疗提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 NO的物理化学性质
• 2 NO 在动物体中的研究
• 3 NO 在植物中的研究
• 4 NO 在微生物中的研究
• 5 小结和本论文的研究内容
• 第一部分 S. aureus RN6390 生物膜和浮游菌中nos 基因表达的差异及外源 NO 对生物膜的影响
• 1 实验材料和仪器
• 1.1 菌株和培养基
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 金黄色葡萄球菌S. aureus RN6390 生物膜模型的构建
• 2.2 定量 PCR 检测 S.aureus RN6390 生物膜及浮游菌中nos基因mRNA的表达差异
• 2.3 NO 供体 SNP 对 S. aureus RN6390 生物膜的影响
• 2.4 NO 清除剂PTIO 对S. aureus RN6390 生物膜的影响
• 3 结果与讨论
• 3.1 S. aureus RN6390 生物膜模型的构建
• 3.2 S. aureus RN6390浮游菌及生物膜细菌中nos基因的表达差异
• 3.3 NO 供体SNP 对S. aureus RN6390 生物膜的影响
• 3.4 NO 清除剂PTIO 对S. aureus RN6390 生物膜的影响
• 4 小结
• 第二部分 一种简便高效的金黄色葡萄球菌电击转化方法的研究
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 溶液及培养基
• 1.4 仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 质粒的大量抽提
• 2.2 金黄色葡萄球菌 RN4220 电击转化感受态的制备
• 2.3 金黄色葡萄球菌 RN4220 的电击转化
• 2.4 该方法的普遍性
• 3 结果
• 3.1 不同处理对转化效率的影响
• 3.2 电击转化率与存活率的关系
• 3.3 该方法应用的普遍性
• 4 小结
• 第三部分 S. aureus RN6390 一氧化氮合酶基因缺失突变株的构建
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 常用缓冲液及溶液
• 1.4 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 打靶载体pMADΔnos的构建
• 2.2 打靶载体pMADΔnos电转入S. aureus RN4220及RN6390
• 2.3 S. aureus RN6390 nos基因缺失突变株的筛选
• 2.4 S. aureus RN6390 nos基因缺失突变株的鉴定
• 3. 结果与讨论
• 3.1 打靶载体pMADΔnos的构建
• 3.2 打靶载体pMADΔnos电转入S. aureus RN4220及RN6390
• 3.3 S. aureus RN6390 nos基因缺失突变株的筛选
• 3.4 S. aureus RN6390 nos基因缺失突变株的鉴定
• 4 小结
• 第四部分 nos 基因缺失对 S. aureus RN6390 生物膜及其抗生素敏感性的影响
• 1 实验材料和仪器
• 1.1 菌株和培养基
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 生物膜实验
• 2.2 最低生物膜消除浓度（MBEC）
• 3 结果与讨论
• 3.1 生物膜形成实验
• 3.2 最低生物膜消除浓度（MBEC）
• 4 小结
• 总结和展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间撰写文章