过量表达BADH基因提高小麦低温耐性的生理机制研究

论文摘要

低温、盐渍、干旱等环境胁迫限制作物的产量和地理分布。植物应对外界环境变化的一个重要方式是合成和积累一些小分子有机物,通常称为相容性物质。甜菜碱是最重要的相容性物质之一。大量的生理、遗传、生物物理、生物化学研究证明:甜菜碱是一种在生物界广泛存在的季胺类化合物,在抵抗环境胁迫中起到重要作用。通过甜菜碱基因工程和外源施加甜菜碱的方法可以提高植物的抗逆性。低温影响小麦的生长发育,降低小麦产量与品质。本研究的目的是探讨过量积累甜菜碱在提高小麦耐冷性中的作用及其机制。试验以三个转菠菜BADH基因的小麦（Triticum aestivum L.）株系T1, T4, T6及其野生型石4185 （WT）为材料,低温02℃胁迫处理12天,室温恢复24天,研究了过量积累甜菜碱对低温胁迫条件下小麦质膜（PM）和类囊体膜的保护作用,并对其生理生化机制进行了探讨。检测指标包括甜菜碱含量、渗透调节能力、质膜H+-ATPase活性、活性氧积累、抗氧化酶活性、有机渗透调节物质的含量、质膜脂肪酸组分、光合荧光参数、叶绿素含量、Hill反应活力、类囊体ATPase活性以及类囊体膜类脂组分等。主要结果如下:1.过量积累甜菜碱对低温胁迫下小麦细胞质膜膜脂组分和完整性具有很好的保护作用。（1）外源BADH基因的导入促进了小麦叶片中甜菜碱水平的提高,同时小麦叶片甜菜碱的积累受低温胁迫的诱导。（2）低温胁迫引起生物膜损伤,导致膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量和膜透性增加。过量积累甜菜碱使转基因株系细胞膜受低温伤害的程度较轻,表现为比野生型较低的膜脂过氧化程度和电解质外渗量。（3）低温胁迫引起转基因株系和野生型小麦叶片中质膜H+-ATPase活性的降低,说明低温对膜上的蛋白造成伤害。转基因株系质膜H+-ATPase活性降低的幅度比野生型小,说明甜菜碱对膜上的蛋白有保护作用。同时转基因系中质膜H+-ATPase活性在低温过后恢复过程也比野生型快。（4）低温胁迫导致超氧阴离子自由基（O2-）生成速率和过氧化氢（H2O2）浓度增加。过量积累甜菜碱的转基因株系中主要抗氧化酶（SOD, CAT, POD, APX）的活性相对较高,超氧阴离子生成速率和过氧化氢浓度较低,有效降低了低温胁迫导致的氧化胁迫。（5）过量积累的甜菜碱除了本身是一种有效的渗透调节物质以外,还通过促进其他有机渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的积累,维持低温胁迫下小麦叶片的渗透调节能力,防止细胞由于低温脱水引起的细胞膜功能紊乱。（6）低温胁迫下细胞质膜丧失稳定性,其结构和组分容易受到破坏。过量积累甜菜碱的转基因株系质膜脂肪酸组分和不饱和度相对稳定,这有利于维持低温下质膜的正常功能。2.过量积累甜菜碱通过改善脂类的组分和保护类囊体膜上功能蛋白来维持相对较高的光合作用能力。（1）低温胁迫导致小麦叶片光合机构损伤,表现为光合速率、PSⅡ光化学效率、叶绿素含量、Hill反应活力以及类囊体膜上Ca2+-ATPase, Mg2+-ATPase活性下降。相对于野生型植株,过量积累甜菜碱的转基因植株碳同化速率、PSⅡ光化学效率和气孔导度的下降得到缓解,叶绿素的降解、Hill反应活力和类囊体膜ATPase活性的下降相对缓慢。（2）对WT和T6的类囊体膜脂相对含量进行分析发现,低温胁迫过程中,WT和T6类囊体膜脂中的MGDG相对含量下降,DGDG和PG相对含量升高,而SQDG和PC无明显变化。但是转基因株系T6类囊体膜脂在低温下MGDG相对含量比WT低,而DGDG和PG相对含量比WT高。这种变化使类囊体膜非双层结构形成的倾向降低,增加膜双层结构的稳定性,有利于提高抗低温胁迫能力。（3）对WT和T6的类囊体膜脂肪酸组分进行分析发现,低温胁迫下转基因株系T6类囊体膜的不饱和指数以及各种类脂脂肪酸含量较野生型相对稳定。结合类囊体膜上各类脂及脂肪酸的特性推测,转BADH基因小麦由于过量积累甜菜碱,较好的维持了低温胁迫下类囊体膜上各组分,包括膜脂组分、色素及各蛋白复合体功能的稳定性,在低温胁迫下光合作用降低幅度小,温度恢复后的光合活性恢复快,进而使转基因小麦在温度恢复后能够快速恢复生长,低温胁迫耐性提高。综上所述,转BADH基因的小麦由于过量积累甜菜碱,提高了质膜和类囊体膜对低温胁迫的适应能力,究其原因可能主要有以下几个方面: （1）甜菜碱及其诱导产生的渗透调节物质的积累提高了细胞的渗透调节能力,直接或间接的保护各种酶的结构和功能;（2）通过维持或提高抗氧化酶的活性增强活性氧清除能力,减少活性氧的积累,减轻膜脂过氧化水平,维持质膜和类囊体膜的完整性和流动性;（3）过量积累甜菜碱可以维持低温胁迫下细胞质膜和类囊体膜上蛋白复合体的稳定性,使其在低温下行使正常的功能;（4）转BADH基因小麦中不饱和脂肪酸水平提高可能与膜的稳定性和抗冷性提高有关,并且这种不饱和脂肪酸水平的提高是组成型的,不是冷诱导的结果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 引言
• 1.1 甜菜碱的合成途径
• 1.2 甜菜碱的生理功能
• 1.2.1 渗透调节功能
• 1.2.2 非渗透调节功能
• 1.2.2.1 对光合机构的保护作用
• 1.2.2.2 对酶活性的保护作用
• 1.2.2.3 对生物膜及膜蛋白的保护作用
• 1.2.2.4 影响其它相容性物质在植株体内的含量和分布
• 1.2.2.5 甜菜碱对基因表达的影响
• 1.3 甜菜碱的应用
• 1.3.1 外源甜菜碱研究的应用
• 1.3.2 甜菜碱基因工程
• 1.4 本研究的目的意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.2 材料培养和低温胁迫处理
• 2.3 指标测定
• 2.3.1 甜菜碱含量测定
• 2.3.2 MDA 含量和电解质外渗量
• 2.3.3 抗氧化酶活性测定
• 2.3.4 脯氨酸和可溶性糖测定
• 2.3.5 超氧阴离子自由基测定
• 2.3.6 过氧化氢含量测定
• 2.3.7 质膜的提取和纯化
• +-ATPase 活性测定'>2.3.8 PM H⁺-ATPase 活性测定
• 2.3.9 PM 脂肪酸组分分析
• 2.3.10 叶绿素含量测定
• 2.3.11 光合参数的测定
• 2.3.12 叶绿素荧光参数的测定
• 2.3.13 叶绿体的制备
• 2+-ATPase、Mg²⁺-ATPase 活性测定'>2.3.14 类囊体 Ca²⁺-ATPase、Mg²⁺-ATPase 活性测定
• 2.3.15 Hill 反应活性的测定
• 2.3.16 类囊体膜极性脂的提取和脂肪酸组分分析
• 2.3.16.1 极性脂的提取与分析
• 2.3.16.2 叶绿素浓度的测定
• 2.3.16.3 极性脂分离
• 2.3.16.4 脂类的甲酯化
• 2.4 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 过量积累甜菜碱对低温胁迫条件下小麦质膜的保护作用
• 3.1.1 过量表达 BADH 基因对小麦叶片甜菜碱、脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白的影响
• 3.1.2 低温胁迫对不同株系小麦叶片相对电导率和 MDA 含量的影响
• +-ATPase 活性的影响'>3.1.3 低温胁迫对不同株系小麦叶片质膜 H⁺-ATPase 活性的影响
• 3.1.4 低温胁迫对小麦叶片超氧阴离子自由基生成速率和过氧化氢含量的影响
• 3.1.5 低温胁迫对小麦叶片抗氧化酶活性的影响
• 3.1.6 低温胁迫对小麦叶片质膜脂肪酸组分的影响
• 3.2 过量积累甜菜碱对低温胁迫条件下小麦类囊体膜功能的保护作用
• 3.2.1 低温胁迫对不同小麦株系地上部生物量的影响
• 3.2.2 低温胁迫对小麦叶片光合作用和叶绿素荧光参数的影响
• 3.2.3 低温胁迫对小麦叶片光合色素含量的影响
• 3.2.4 低温胁迫对小麦Hill 反应活性的影响
• 2+-ATPase 和 Mg²⁺-ATPase 活性的影响'>3.2.5 低温胁迫对小麦类囊体膜 Ca²⁺-ATPase 和 Mg²⁺-ATPase 活性的影响
• 3.2.6 低温胁迫对小麦类囊体膜类脂组分及脂肪酸不饱和度的影响
• 4. 讨论
• 4.1 过量表达BADH 基因提高了小麦叶片甜菜碱的积累量
• 4.2 过量积累甜菜碱对低温胁迫条件下小麦质膜的保护作用
• 4.3 过量积累甜菜碱对低温胁迫条件下小麦叶片光合机构的保护作用
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况