鸡传染性法氏囊病抗体快速检测试纸条的研制及初步应用

论文摘要

鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的一种鸡的急性、高度接触性传染病,给世界各国的家禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今,新的变异株及超强毒株的出现,使得传统疫苗已不能控制其流行,这进一步增加了该病的防制难度。开展血清抗体检测是防制该病的重要措施之一,目前IBD血清抗体检测方法主要有琼脂凝胶扩散法、微量血清中和试验法及酶联免疫吸附试验法。但这些方法由于费时或成本高等因素的制约,主要用于实验室检测,不适合基层检测。因此,研制一种适合基层兽医或养殖个体进行快速检测IBD血清抗体的方法,对防制IBD是必要的。本研究运用胶体金免疫层析技术,建立一种快速检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的胶体金免疫层析方法,取得了如下成果:1.IBDV结构蛋白（VP2）基因的原核表达及表达蛋白的纯化和免疫活性鉴定携带IBDV-VP2基因的pKG-VP2表达质粒在大肠杆菌BL21（DE3）plys S中进行表达,并对表达条件进行优化,结果显示pKG-VP2在30℃条件下诱导6h后表达量最佳,表达物分子量约为66KDa。Western-blot证实重组蛋白具有较好的免疫学活性。经GST标签蛋白亲和层析柱纯化,我们获得高纯度的表达蛋白,浓度为1.01mg/mL,为IBDV抗体检测试纸条奠定了物质基础。2.快速检测IBD血清抗体胶体金免疫层析试纸条的研制（1）复苏和增殖抗鸡IgG Fc段杂交瘤细胞株,注射小鼠,产生腹水,通过辛酸-硫酸铵法纯化,获得了高纯度的抗鸡IgG Fc段单克隆抗体。（2）采用柠檬酸三钠还原法,成功确立了20nm胶体金的制备条件:利用制备好的胶体金,对抗鸡IgG Fc单克隆抗体的胶体金标记条件的摸索,成功确立了最适标记条件:每ml胶体金最适添加7μL 0.1mol/L K2CO3和8μg抗鸡IgG Fc段单克隆抗体。（3）用胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为探针,用纯化的VP2蛋白和兔抗鼠IgG分别作为检测线试剂和质控线试剂,研制了一种快速检测IBD血清抗体试纸条,并对其特异性和敏感性进行了测试。特异性结果显示,试纸条检测IBDV阳性血清时,检测线出现明显的紫红色条带,呈阳性反应;而鸡的其它疾病阳性血清如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和SPF鸡血清、生理盐水均显示阴性反应。用琼脂凝胶扩散试验检测临床血清样品获得20份阳性样品,然后分别用试纸条和琼脂凝胶扩散试验检测这20份血清样品的效价,结果显示试纸条较琼脂凝胶扩散试验敏感8倍。3.快速检测IBD血清抗体胶体金免疫层析试纸条的临床初步应用在建立的快速检测方法的基础上,我们研制出鸡传染性法氏囊病血清抗体快速检测试剂盒。用该试剂盒检测临床采集的216份血清样品,阳性检出率为60.19%,与琼脂凝胶扩散法符合率为68.52%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（ABBREVIATION）
• 第1章 文献综述
• 1 鸡传染性法氏囊病的研究进展
• 1.1 IBDV的病原学
• 1.1.1 病毒学分类、形态及理化特性
• 1.1.2 病毒培养特性
• 1.1.3 病毒血清型
• 1.1.4 IBDV的基因组结构和编码的蛋白
• 1.2 IBD的流行病学
• 1.2.1 自然宿主
• 1.2.2 传播媒介
• 1.2.3 传染源和传播途径
• 1.2.4 近年该病的流行出现了新特点
• 1.3 IBD诊断方法研究进展
• 2 胶体金免疫层析技术研究进展
• 2.1 胶体金免疫层析技术的原理
• 2.1.1 胶体金的定义和特点
• 2.1.2 胶体金标记技术
• 2.1.3 免疫胶体金技术
• 2.1.4 免疫层析技术
• 2.1.5 胶体金免疫层析技术
• 2.1.5.1 抗体夹心法
• 2.1.5.2 间接法
• 2.1.5.3 竞争抑制法
• 2.2 胶体金免疫层析技术的优点
• 2.2.1 快捷迅速,大大缩短出结果时间
• 2.2.2 灵敏准确
• 2.2.3 结果受外界因素影响较小
• 2.2.4 安全简便,不需任何仪器和设备
• 2.2.5 成本低廉,所需试剂和样本量少
• 2.3 胶体金免疫层析试纸条的制备流程
• 2.3.1 胶体金的制备
• 2.3.2 金标抗体的制备、纯化及保存
• 2.3.3 胶体金免疫层析试纸条的结构及检测原理
• 2.4 胶体金免疫层析技术在兽医领域的应用
• 2.4.1 病毒性疾病的诊断
• 2.4.2 细菌性疾病的诊断
• 2.4.3 寄生虫病的诊断
• 2.4.4 血、尿残留药物浓度的检测
• 2.5 胶体金免疫层析技术的研究趋势
• 2.5.1 提高胶体金质量
• 2.5.2 进一步提高检测灵敏度,拓宽检测范围
• 2.5.3 实现多项检测
• 2.5.4 实现半定量或定量测定
• 3 研究目的与意义
• 第2章 IBDV的VP2基因的原核表达及表达蛋白的纯化和免疫活性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 质粒、细菌及主要试剂
• 1.1.2 主要试剂及溶液的配制
• 1.1.2.1 抗生素类
• 1.1.2.2 常用贮存液的配制
• 1.1.2.3 SDS-PAGE和Western-blot试剂
• 1.1.2.4 GST标签蛋白亲和层析纯化柱配方
• 1.2 方法
• 1.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.2 重组表达质粒的转化
• 1.2.3 诱导表达
• 1.2.4 蛋白浓度的测定
• 1.2.5 SDS-PAGE电泳
• 1.2.6 Western-blot
• 2 结果与分析
• 2.1 重组菌诱导表达及目标蛋白纯化的SDS-PAGE电泳结果
• 2.2 Western-blot分析
• 2.3 蛋白浓度的测定
• 3 讨论
• 3.1 表达载体和表达菌的选择
• 3.2 诱导表达条件的选择
• 3.3 对VP2蛋白表达量低的分析
• 4 结论
• 第3章 鸡传染性法氏囊血清抗体胶体金免疫层析方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器和材料
• 1.1.2 抗体、血清、抗原及化学试剂
• 1.1.3 溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的制备与纯化
• 1.2.1.1 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的制备
• 1.2.1.2 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的纯化
• 1.2.2 胶体金的制备
• 1.2.3 胶体金颗粒的鉴定
• 1.2.4 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记胶体金pH值
• 1.2.5 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记量的确定
• 1.2.6 金标单抗复合物的制备与纯化
• 1.2.7 封闭液的选择
• 1.2.8 样品垫、金标垫的制备
• 1.2.9 点样
• 1.2.10 试纸条的组装及结果判定标准
• 1.2.11 试纸条特异性试验
• 1.2.12 试纸条敏感性试验
• 1.2.13 快速检测鸡传染性法氏囊血清抗体试剂盒组装及初步应用
• 1.2.13.1 快速检测鸡传染性法氏囊血清抗体诊断试剂盒的组成
• 1.2.13.2 快速检测鸡传染性法氏囊病血清抗体诊断试剂盒性能考察
• 1.2.13.3 快速检测鸡传染性法氏囊病血清抗体诊断试剂盒的初步应用
• 2 结果与分析
• 2.1 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的纯化
• 2.2 胶体金的制备
• 2.3 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记胶体金pH值
• 2.4 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记量的确定
• 2.5 封闭液的选择
• 2.6 检测线和质控线包被物浓度的选择
• 2.7 试纸条特异性试验
• 2.8 试纸条敏感性试验
• 2.9 试剂盒的重复性试验和保存期试验
• 2.10 试剂盒的临床应用
• 3 讨论与结论
• 3.1 胶体金颗粒制备及鉴定
• 3.2 胶体金标记的单克隆抗体的制备
• 3.3 胶体金标记物抗鸡IgG Fc段单克隆抗体
• 3.4 封闭液的选择
• 3.5 点样量的确定
• 3.6 血清样品稀释倍数的确定
• 3.7 血清样品对试纸条敏感度的影响
• 3.8 快速检测鸡传染性法氏囊血清抗体诊断试剂盒的应用
• 4 结论
• 总结
• 参考文献
• 致谢