可溶性全长hPPARγ重组蛋白的制备及其活性研究

论文摘要

PPARγ（peroxisome proliferator activatived receptor γ，过氧化物酶体增殖物激活受体）是核激素受体超家族中的非常重要成员之一，除在脂肪组织中高表达外，在肺、结肠、乳腺、卵巢等组织也有不同程度的高表达。PPARγ既可参与调控细胞内脂肪代谢和糖代谢，又可抑制肿瘤细胞增殖、分化以及促进细胞凋亡、转运等。因此，PPARγ是肿瘤细胞信号传导途径中的重要靶点蛋白，现已成为热点研究的核受体之一。外源性制备hPPARγ重组蛋白（Human Peroxisome proliferator-activated receptor γ），能够为其相关分子靶向药物的筛选打下坚实的基础。为此，本文拟制备可溶性全长hPPARγ重组蛋白，并对其活性进行研究，其主要研究内容及结果如下：1.采用带有六个组氨酸[His]6的泛素化小修饰蛋白（SUMO）为融合表达标签，设计并构建可溶性全长hPPARγ重组蛋白的表达质粒pReceiver-B13-SUMO-hPPARγ，经质粒转化，细菌培养，在优化条件（16℃、IPTG浓度0.5mM、诱导时间20h）下，表达出可溶性全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白，经SDS-PAGE电泳分析，与hPPARγ蛋白的理论分子量（67.2kDa，包括[His]6-SUMO）是一致的。2.采用Ni2+亲和色谱柱于变性条件下一步纯化目标蛋白，优化纯化条件，可获得纯度为90%的全长[His]6-SUMO-hPPARγ变性重组蛋白。变性目标蛋白经透析复性后，能获得可溶性全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白。3.利用DEAE-52阴离子交换树脂在非变性条件下一步纯化目标蛋白，用NaCl溶液梯度洗脱目标蛋白，从每升LB培养介质中可获得135mg、纯度为80%的可溶性全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白。4.采用分子排阻色谱-高效液相色谱法（size exclusion chromato-graphy-high performance chromatography，SEC-HPLC），测定了全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白与Ros（Rosiglitazone，罗格列酮）配体结合活性，其Kd值为492nM，结合率约为70%。综上所述，本文建立以带有[His]6组氨酸的泛素化小修饰蛋白为融合表达标签的质粒、重组表达、纯化得到具有生物学活性的可溶性全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白的制备方法，采用DEAE-52阴离子交换树脂一步纯化法，从每升培养液中可制备得到135mg、纯度为80%的全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白。为建立基于全长hPPARγ重组蛋白为作用靶点蛋白的抗肿瘤药物筛选平台奠定了基础。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 可溶性全长 hPPARγ重组蛋白的表达
• 1 实验材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二部分 可溶性全长 hPPARγ重组蛋白的纯化
• 1 实验材料
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三部分 可溶性全长 hPPARγ重组蛋白体外活性研究
• 1 实验材料
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文