论文摘要
OsMPEC是从水稻中新分离的基因,它所编码的蛋白质含有一个碱性亮氨酸拉链结构域及一个[EXn DEXRH]2基序。同时,从高等植物到微生物,均发现了其同源基因的存在,如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、裂叶牵牛（Pharbitis nil）、大戟（Euphorbia esula）、绿藻（Chlamydomonas renhardtii）、紫色细菌（Rubrivivax gelatinosus）等。这类基因在高等植物之间保守性很高,在能进行光合作用的微生物（如绿藻、紫色细菌等）中也具有相当高的保守性。通过在紫细菌、拟南芥和大麦中同源基因的研究初步证明该类基因编码叶绿素合成途径中的关键酶--镁原卟啉甲酯环化酶,在光合生物中发挥重要作用。但目前有关该基因在分子生物学水平的研究还很初步,有许多问题尚待解决,因此对该基因表达特性进行深入研究,阐明其作用机制具有非常重要的意义。本实验室已从多种植物中克隆到OsMPEC同源基因,本课题选取重要粮食作物水稻作为研究材料,对OsMPEC基因在多种胁迫条件下的表达情况进行了检测,并通过转基因技术对其功能进行了初步分析,主要结果如下:1.通过同源比对,从水稻基因组序列中检索到水稻OsMPEC全序列,该基因全长2559bp,5’和3’非编码区分别长38bp和679bp,共有四个内元。其中编码区长1227bp,编码一个409aa的多肽,推断其分子量为47.3KD。OsMPEC与PNZIP, NTZIP, CHL27和Xantha-l基因分别具有79.17%,78.19%,78.83%和87.08%的同源性,通过对它们氨基酸序列的比较发现,这些基因所编码的氨基酸序列中含有两个EXnDEXRH基序及一个保守的亮氨酸拉链结构。2. Northern杂交分析表明OsMPEC表达呈组织特异性,在叶片中表达量最高,茎中表达量稍低,在根中则几乎检测不到它的表达。3.高温和低温处理均可以诱导OsMPEC基因表达,序列分析发现在该基因启动子中存在多个胁迫响应元件,如ABREs （ABA-response elements）、AREs （anaerobic induction elements）和TC-rich repeats （defense and stress responsive elements）。4.缺氧胁迫、缺铁胁迫和铜胁迫均可以明显抑制OsMPEC基因的表达,同时相应处理下水稻幼苗中叶绿素的含量也发生明显降低,这说明适当的Fe,Cu和O2浓度对维持OsMPEC基因的正常表达非常重要。5.转正义基因植株无论在萌发、生长过程、种子数目及叶绿素含量上均与野生型水稻没有明显区别。但转反义OsMPEC的水稻幼苗普遍呈现不同程度的褪绿表型,从黄绿色至黄色不等,并且大部分反义株系植株的后代都出现萌发及生长缓慢的特征,一些OsMPEC的表达受到严重抑制的株系在萌发后不久即枯黄死亡。这些结果证明,OsMPEC基因表达量的减少导致了转反义基因植株叶绿素含量的降低,造成褪绿和生长迟缓的表型。6.生理实验结果表明转反义基因植株的Fv/Fm和ΦPSII没有明显的区别。另外,所有转反义基因植株的ΔI/I0均发生明显降低,并且降低程度与其叶片黄化程度相一致,在OsMPEC表达水平较低的株系中其ΔI/I0仅为野生型植株的一半,说明OsMPEC基因表达量的减少将影响水稻幼苗PSI的功能,但对PSII的功能影响不大。microRNA（miRNA）在多个物种中被广泛发现,而且在进化上高度保守,它们在生物体中行使重要发育调控功能,成为当今研究热点。现已发现非编码RNA参与了生命活动的多个步骤:转录、染色体的形成、RNA的剪切和修饰、mRNA的稳定和翻译、蛋白质的稳定和转运等。但目前有关miRNA的研究还很初步,在动植物中还有大量的非编码RNA未被我们发现,而且许多已发现的小RNA的功能还有待我们进一步去探索,它们将是生命科学领域里新的研究热点,对植物中现有miRNA研究可以帮助我们揭示更多生命的奥秘。以往研究者对miRNA功能的研究大多集中在其对动植物发育过程的调控,并且取得了很多有价值的研究成果,揭示了miRNA在发育过程中所发挥的重要作用。近些年来,有研究者发现miRNA也可以受到外源环境胁迫的调节,这使得人们对miRNA的功能又有了新的认识,因此研究逆境胁迫响应的miRNA及其在植物抵抗逆境胁迫过程所发挥的作用成为分子生物学新的研究热点。本实验以拟南芥为研究材料,利用miRNA芯片技术,研究了拟南芥中已知117条miRNA在受到高盐、干旱和冷处理后的表达变化情况。为了验证芯片结果的可靠性,我们采用RT-PCR的方法对所得到的胁迫诱导miRNA在三种处理下诱导表达进行了验证,同时检测了它们在不同时间点的表达模式,并对这些miRNA的启动子进行了初步分析,主要试验结果如下:1.通过miRNA芯片实验,发现了14个miRNA在受到三种胁迫处理时表达量发生变化,其中有10个miRNA响应高盐信号、4个响应干旱信号,还有10个响应冷信号。miR165、miR319和miR393在受到高盐和冷处理时表达量上调,miR167受高盐和干旱处理诱导,而miR168, miR171和miR396在三种胁迫条件下均诱导表达。2. RT-PCR实验证明miRNA芯片结果可信,同时对胁迫诱导miRNA在不同处理下不同时间点的表达模式进行了检测,证明这些miRNA的表达可以受到胁迫环境调节,而且部分miRNA可以同时响应多种胁迫处理。3.分离了miRNA基因上游1000bp序列,分析发现在这些区域存在胁迫响应顺式作用元件,如ABREs （ ABA-response elements ）、AREs （ anaerobic inductionelements）、MBS（MYB binding site involved in drought-inducibility）、HSEs（heat stress responsive elements）、LTRs （low-temperature responsive elements）、TC-rich repeat（defense and stress responsive elements）,进一步证明这些miRNA可以参与植物胁迫响应过程。4.通过对转有miR159a, miR393a, miR398a和miR443前体上游序列驱动的gus报告基因的转基因拟南芥进行GUS染色和GUS活性测定,发现所分离4段miRNA的前体上游序列均具有启动子活性,并且miR159a的启动子活性比35S启动子高接近6倍,为超强表达启动子。5.不同miRNA启动子的转基因拟南芥在不同发育时期的GUS组织染色结果显示,miR159a启动子为组成型启动子, miRNA398a启动子驱动的gus基因主要在拟南芥的根、茎和叶中表达, miR393a和miR443启动子为特异型,其中miR393a启动子驱动的gus主要在拟南芥的叶片主脉和主根中表达,而miR443启动子驱动的gus在拟南芥的幼叶和幼叶根毛处表达。miRNA的表达模式与其启动子所驱动的gus基因的表达模式基本一致。