法舒地尔对肺纤维化的保护作用和吡非尼酮治疗肺纤维化的副作用

论文摘要

第一部分法舒地尔对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的干预作用及其可能机制研究目的建立博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型,观察法舒地尔对肺纤维化的干预作用,并进一步探讨可能的机制。研究方法1.应用单次气管内注入博莱霉素（2.5mg/kg）的方法建立小鼠肺纤维化模型,并通过腹腔内注射法舒地尔（10mg/kg/d、30mg/kg/d、100mg/kg/d）对小鼠肺纤维化进行干预。2.观测小鼠呼吸、活动、进食、毛发及体重情况,肺组织病理切片Ashcroft评分及羟脯氨酸测定评估小鼠肺纤维化的严重程度。3.采集小鼠支气管肺泡灌洗液,进行炎症细胞浸润的总数和分类计数。应用ELISA法测定BALF中PAI-1蛋白含量。4.应用RT-PCR法测定小鼠肺组织中TGF-β1、CTGF、α-SMA、PAI-1mRNA的表达水平。5.应用Western blot法测定小鼠肺组织中TGF-β1、CTGF、a-SMA蛋白的表达水平及MYPT1磷酸化水平。结果1.高剂量及中剂量法舒地尔能显著降低博莱霉素诱导小鼠的肺纤维化评分和肺组织的羟脯氨酸含量。2.高剂量及中剂量法舒地尔能显著降低博莱霉素诱导小鼠BALF中第7、14、21天的炎症细胞浸润的细胞总数和巨噬细胞数,和第7天的中性粒细胞数。3.高剂量及中剂量法舒地尔能显著降低博莱霉素诱导小鼠肺组织中TGF-β1、 CTGF、α-SMA、PAI-1的基因和蛋白表达水平。4.高剂量法舒地尔能显著下调博莱霉素诱导小鼠肺组织中MYPT1磷酸化水平。结论1.法舒地尔对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化具有保护作用,可以显著降低肺泡炎和肺纤维化程度。2.法舒地尔对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的保护作用可能是通过抑制炎症细胞募集和TGF-β1、CTGF、α-SMA、PAI-1的表达。第二部分法舒地尔对NIH3T3成纤维细胞生物学行为的影响及其可能机制研究目的体外培养NIH3T3成纤维细胞,观察法舒地尔对细胞增殖和迁移能力的影响,并进一步探讨可能的机制。研究方法1.体外培养NIH3T3成纤维细胞,给予法舒地尔（1μg/ml、10μg/ml）对细胞进行干预。2.应用MTT实验、平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。3.应用划痕实验、Transwell小室实验检测细胞迁移能力。4.应用RT-PCR法测定细胞CyclinDl、MMP2、TIMP1mRNA的表达水平。5.应用Western blot法测定细胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表达水平及MYPT1磷酸化水平。结果1.MTT实验结果显示法舒地尔可呈时间和浓度依赖性地降低NIH3T3细胞的OD值。平板克隆形成实验结果显示法舒地尔可呈浓度依赖性地降低NIH3T3细胞的克隆数。2.划痕实验结果显示法舒地尔可呈浓度依赖性地缩短NIH3T3细胞的迁移距离。Transwell小室实验结果显示法舒地尔可呈浓度依赖性地减少迁移穿过基底膜的NIH3T3细胞数量。3.高浓度法舒地尔可显著降低NIH3T3细胞CyclinD1的基因和蛋白表达水平,增加TIMP1基因和蛋白的表达水平,法舒地尔可呈浓度依赖性地降低MMP2基因和蛋白的表达水平。4.法舒地尔可呈浓度依赖性地下调NIH3T3细胞MYPT1磷酸化水平。结论1.法舒地尔可呈时间和浓度依赖性地抑制NIH3T3细胞的增殖能力,可能是通过抑制NIH3T3细胞CyclinDl的表达。2.法舒地尔可呈浓度依赖性地抑制NIH3T3细胞的平面和纵向迁移能力,可能是通过抑制NIH3T3细胞MMP2的表达且增加TIMP1的表达。第三部分吡非尼酮治疗肺纤维化的副作用评价研究目的吡非尼酮是目前标明IPF为适应症的唯一上市药品,但是吡非尼酮治疗肺纤维化的副作用尚无系统研究。本研究通过对己发表的文献进行meta分析评价其治疗肺纤维化患者的副作用。研究方法系统检索PubMed、Embase、Cochrane Central Register of Controlled Trials和ClinicalTrials.gov四个数据库,纳入1999年1月至2011年10月吡非尼酮用于治疗肺纤维化的临床研究。两名评价者独立筛选文献。应用Review manager5.0.24软件分析数据。结果1.六个随机对照试验（共1073名参与者）符合纳入标准。2.和安慰剂组相比,吡非尼酮组因副作用中途退出治疗患者显著增多。3.和安慰剂组相比,吡非尼酮组在以下系统的副作用发生率显著升高：消化系统（包括恶心、消化不良、腹泻和食欲不振）,神经精神系统（包括眩晕和乏力）,皮肤（包括光过敏和皮疹）。结论吡非尼酮治疗肺纤维化总体安全和耐受性尚存在问题,应用吡非尼酮时需注意到其在消化系统、神经精神系统和皮肤方面的副作用,及早预防。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分：法舒地尔对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的干预作用及其可能机制
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要仪器和实验耗材
• 1.1.3 主要实验试剂
• 1.1.4 主要溶液的配置
• 1.2 实验动物分组及技术路线
• 1.2.1 实验动物分组
• 1.2.2 技术路线
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 动物模型的建立
• 1.3.2 药物干预
• 1.3.3 标本采集
• 1.3.4 肺组织切片染色
• 1.3.5 支气管肺泡灌洗液处理及细胞甩片染色
• 1.3.6 肺组织纤维化Ashcroft评分
• 1.3.7 肺组织羟脯氨酸含量测定
• 1.3.8 RT-PCR
• 1.3.9 Western blot
• 1.3.10 ELISA
• 1.4 统计学分析
• 2 实验结果
• 2.1 一般情况观察
• 2.2 肺组织病理
• 2.2.1 大体改变
• 2.2.2 HE及Masson染色
• 2.2.3 Ashcroft评分
• 2.3 肺组织羟脯氨酸测定
• 2.4 支气管肺泡灌洗液结果
• 2.4.1 细胞总数
• 2.4.2 巨噬细胞计数
• 2.4.3 中性粒细胞计数
• 2.4.4 淋巴细胞计数
• 2.5 RT-PCR检测法舒地尔对博莱霉素诱导小鼠肺组织TGF-β1、CTGF、α-SMA、PAI-1 mRNA表达的影响
• 2.6 Western blot检测法舒地尔对博莱霉素诱导小鼠肺组织TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白表达的影响
• 2.7 ELISA检测法舒地尔对博莱霉素诱导小鼠BALF中PAI-1蛋白表达的影响
• 2.8 Western blot检测法舒地尔对博莱霉素诱导小鼠肺组织MYPT1磷酸化水平的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二部分：法舒地尔对NIH3T3成纤维细胞生物学行为的影响及其可能机制
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验细胞
• 1.1.2 主要仪器和实验耗材
• 1.1.3 主要实验试剂
• 1.1.4 主要溶液的配置
• 1.2 实验分组及技术路线
• 1.2.1 实验分组
• 1.2.2 技术路线
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 细胞培养
• 1.3.2 药物干预
• 1.3.3 MTT实验
• 1.3.4 平板克隆形成实验
• 1.3.5 细胞平面迁移实验
• 1.3.6 细胞纵向迁移实验
• 1.3.7 RT-PCR
• 1.3.8 Western blot
• 1.4 统计学分析
• 2 实验结果
• 2.1 MTT法检测法舒地尔对NIH3T3细胞增殖的影响
• 2.2 平板克隆形成实验检测法舒地尔对NIH3T3细胞增殖的影响
• 2.3 划痕实验检测法舒地尔对NIH3T3细胞平面迁移能力的影响
• 2.4 Transwell小室迁移实验检测法舒地尔对NIH3T3细胞纵向迁移能力的影响
• 2.5 RT-PCR检测法舒地尔对NIH3T3细胞CyclinD1、MMP2、TIMP1 mRNA表达的影响
• 2.6 Western blot检测法舒地尔对NIH3T3细胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白表达的影响
• 2.7 Western blot检测法舒地尔对NIH3T3细胞MYPT1磷酸化水平的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三部分：吡非尼酮治疗肺纤维化的副作用评价
• 1 材料与方法
• 1.1 文献检索策略
• 1.2 纳入试验的选择
• 1.3 数据提取与质量评价
• 1.4 数据分析
• 2 实验结果
• 2.1 入选的临床试验
• 2.2 临床试验的特点
• 2.3 因副作用中途退出治疗患者
• 2.4 消化系统副作用
• 2.5 神经精神系统副作用
• 2.6 皮肤副作用
• 2.7 偏倚
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 综述：Rho/ROCK信号通路与呼吸系统疾病
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢