拟南芥pipe恢复突变体LL-2的研究及PIPE的定点突变

论文摘要

本实验室使用EMS（甲基磺酸乙酯）诱变处理拟南芥,筛选得到一个与表皮细胞发育相关突变体pipe。通过图位克隆的方法克隆到目的基因,该基因编码一种蛋白磷酸酶。本实验在pipe突变体的基础上,经EMS二次诱变,从中筛选得到能够部分恢复pipe突变体矮化表型的株系LL-2。与pipe匕较,LL-2植株明显增高。pipe突变体的莲座叶叶序发生变化,叶片狭小、不规则卷曲,LL-2的莲座叶叶序恢复正常,叶片不具有卷曲现象,但是莲座叶的数目较野生型少。与野生型相比,pipe的莲座叶下表皮扁平细胞明显呈砖块状排列,不具有指状交错的形态,LL-2莲座叶下表皮的扁平细胞呈指状交错排列,恢复为野生型表型。遗传分析证明LL-2突变基因与PIPE基因紧密连锁。对LL-2突变基因进行定位,发现PIPE基因的第547位碱基由C变为T,对应的第183位的氨基酸由组氨酸变成酪氨酸。通过酵母双杂实验,验证PIPEH183Y-BD.PIPEH183YT246M-BD与DELLA的蛋白互作。构建35S-PIPEH183Y-GFP、35S-PIPEH183YT46M-GFP载体,转入野生型和pipe,观察转基因植株表型,发现无明显变化。另外,为了进一步研究PIPE的功能,本论文还定点突变该基因的三个活性位点,构建点突变载体并转入野生型或pipe突变体中,发现转基因植株在表型上与野生型或pipe突变体差别不大。此外,本实验还探讨了拟南芥中CKI（I型酪蛋白激酶）对GA信号途径的影响。对拟南芥中CKI三个同源性较高的激酶基因的T-DNA插入株系进行了鉴定,初步发现激酶的T-DNA插入并不能恢复pipe的表型,表明CKI可能没有参与GA信号途径中DELLA的调节。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 拟南芥是一种模式植物
• 1.1.1 拟南芥所具有的生物学特征
• 1.1.2 拟南芥所具有的分子生物学特征
• 1.2 GA调节植物发育的研究
• 1.2.1 GA对植物发育的调节
• 1.2.2 赤霉素代谢调控及其信号转导
• 1.3 酪蛋白激酶
• 1.3.1 酪蛋白激酶的分类
• 1.3.2 酪蛋白激酶的结构特性
• 1.3.3 酪蛋白激酶的作用
• 1.3.4 展望
• 1.4 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system,Y2H）
• 1.4.1 酵母双杂的原理
• 1.4.2 酵母双杂交系统的改进
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植株,菌种
• 2.1.2 载体,工具酶及试剂
• 2.1.3 常用的试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 拟南芥培养
• 2.2.2 CTAB法提取拟南芥的基因组DNA
• 2.2.3 载体构建及转基因拟南芥表型分析
• 2.2.4 酵母双杂
• 2.2.5 蛋白诱导和纯化
• 2.2.6 蛋白酶活测定
• 2.2.7 激酶T-DNA插入株系的表型分析
• 第三章 结果及分析
• 3.1 恢复突变体LL-2的研究
• 3.1.1 LL-2部分恢复了pipe的表型
• 3.1.2 LL-2的基因定位
• 3.1.3 LL-2的遗传背景分析及纯化
• 3.1.4 pipe突变蛋白与DELLA蛋白的酵母双杂
• 3.1.5 pipe突变蛋白与正常蛋白的酶活测定
• H183Y单突变体和PIPE^H183YT246M双突变体转化植株的表型'>3.1.6 PIPE^H183Y单突变体和PIPE^H183YT246M双突变体转化植株的表型
• 3.2 点突变PIPE基因
• 3.2.1 扩增带入点突变的模板质粒
• 3.2.2 酶切PCR产物
• 3.2.3 带入突变位点质粒模板的获得
• 6110A表达载体构建'>3.2.4 PIPE_6110A表达载体构建
• 3.2.5 筛选转基因植株
• 3.2.6 转基因植株表型分析
• 3.2.7 酵母双杂的结果及显色反应
• 3.3 激酶T-DNA插入株系的表型鉴定
• 3.3.1 激酶T-DNA插入株系信息检索
• 3.3.2 激酶T-DNA插入株系的遗传分析
• 第四章 讨论
• 4.1 二次诱变株系LL-2对pipe的表型有部分恢复
• 4.2 定点突变对PIPE基因功能的影响
• 4.3 激酶T-DNA插入对pipe的影响
• 小结
• 参考文献
• 致谢