巴贝斯虫病LAMP检测方法的建立

论文摘要

巴贝斯虫是一类经蜱传播,红细胞内寄生的原虫,属于复顶亚门,由该类寄生虫引起的牛的巴贝斯虫病（babesiosis）在世界上许多地区发生和流行,是引起热带和亚热带地区牛巴贝斯虫病的主要病原。我国已有14个省（区）报道有本病存在,主要病原为牛巴贝斯虫（Babesia bovis）和双芽巴贝斯虫（Babesia bigemina）,牛患该寄生虫病后,常出现贫血、精神沉郁、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状,严重时引起死亡,给畜牧业和国民经济造成巨大损失。所以对该病的研究就显得十分重要。目前,检测巴贝斯虫病的方法有血液样品的血涂片镜检技术,血清学检查,一般PCR检测技术等,但是这些方法存在低敏感性,交叉感染,假阳性率高的缺点,而且有的方法仪器设备要求比较高,价格昂贵,如实时定量PCR技术。环介导等温扩增技术（LAMP）是Notomi等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。作为一种灵敏的链置换技术,它可以在恒温条件下短时间内将目的DNA从几个拷贝扩增到109-1010拷贝。本研究以巴贝斯虫细胞色素b为靶基因,建立简单、高效、快速的巴贝斯虫属及牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫种的LAMP检测方法,该方法可用于动物巴贝斯虫病的诊断,尤其对该病的早期诊断具有重要的现实意义。从GenBank中获得巴贝斯虫属内各个种的细胞色素b基因序列,应用BLAST进行比对,找出保守区域,根据LAMP引物设计的原则,设计属的特异性引物,建立了针对巴贝斯虫属的细胞色素b基因的LAMP检测方法。以牛的巴贝斯虫的细胞色素b基因为模板,进行LAMP法扩增,并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为254 bp,与预期扩增大小一致。该LAMP检测体系的特异性强,不能在牛瑟氏泰勒虫DNA、马泰勒焦虫DNA、弓形虫DNA、羊泰勒焦虫DNA中扩增出条带；敏感性高,双芽巴贝斯虫最低检测的DNA含量为0.85 fg/μL,牛巴贝斯虫最低检测的DNA含量为0.14 fg/μL。为了进一步检测巴贝斯虫种的分类,本研究建立了牛双芽巴贝斯虫种的LAMP检测方法。根据公布的牛双芽巴贝斯虫细胞色素b的DNA序列设计特异性引物,构建牛巴贝斯虫病的LAMP检测体系。对巴贝斯虫样品进行LAMP扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段符合预期的设计。该LAMP检测体系的特异性强、敏感性高,牛双芽巴贝斯虫细胞色素b基因能够检测到的最低含量为0.085 fg/μL。该检测体系的成功构建为动物感染牛巴贝斯虫病的诊断和流行病学调查提供了技术支撑。针对牛巴贝斯虫病也是目前危害牛健康的主要常见病,本研究还建立了牛巴贝斯虫种的LAMP检测方法。根据公布的牛巴贝斯虫细胞色素b的DNA序列设计特异性引物,应用LAMP方法对巴贝斯虫样品进行扩增并进行敏感和特异性检测。结果表明,该LAMP检测体系的敏感性高,牛巴贝斯虫细胞色素b基因能够检测到的最低含量为0.014 fg/μL。特异性较强,除能扩增出牛巴贝斯虫的特异性片段外,双芽巴贝斯虫DNA、马泰勒焦虫DNA、羊泰勒焦虫DNA等为模板都不能扩增特异性条带。该方法可用于牛感染牛巴贝斯虫病的检测、鉴定和流行病学调查。综上所述,本研究建立了牛巴贝斯虫属LAMP检测方法及双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫种的LAMP检测方法,敏感性比PCR方法要高,特异性较强,能方便快捷地检测,可用于巴贝斯虫病现场检测和流行病学调查,应用前景广阔。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 文献综述
• 第一章 巴贝斯虫和巴贝斯虫病
• 1 虫体形态
• 2 巴贝斯虫病的流行
• 3 巴贝斯虫病的危害
• 4 诊断
• 4.1 临床症状
• 4.2 血液的检查
• 4.3 解剖尸体
• 4.4 流行病学调查
• 5 治疗
• 5.1 药物治疗
• 5.2 阻断传播媒介,消灭蜱
• 5.3 病牛和带虫牛群集中饲养,彻底治疗
• 6 小结
• 第二章 巴贝斯虫检测研究进展
• 1 常规检测方法
• 2 血涂片镜检技术
• 3 蜱传播实验
• 4 分子生物学方法
• 5 小结
• 第三章 环介导等温扩增技术的原理及应用
• 1 LAMP方法的介绍
• 2 LAMP方法的原理
• 2.1 LAMP引物
• 2.2 LAMP反应过程
• 3 LAMP方法的特点
• 3.1 扩增反应鉴别方便、快捷
• 3.2 LAMP反应特异性强、灵敏度高
• 3.3 LAMP反应扩增效率高
• 3.4 实验装置简单
• 4 小结
• 研究内容
• 第一章 巴贝斯虫属LAMP方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 B.bovis DNA基因克隆
• 1.3 LAMP方法的建立
• 1.4 LAMP特异性试验
• 1.5 LAMP敏感性试验
• 1.6 重复性试验
• 2 结果
• 2.1 反应体系的优化
• 2.2 特异性试验结果
• 2.3 敏感性试验结果
• 2.4 重复性试验结果
• 3 讨论
• 第二章 快速检测双芽巴贝斯虫LAMP方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 B.bigemina LAMP方法的建立
• 1.3 B.bigemina cyt b基因PCR检测方法的建立
• 1.4 LAMP特异性试验
• 1.5 LAMP敏感性试验
• 1.6 重复性试验
• 2 结果
• 2.1 反应体系的优化
• 2.2 特异性试验结果
• 2.3 敏感性试验结果
• 2.4 重复性试验结果
• 3 讨论
• 第三章 快速检测牛巴贝斯虫LAMP方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 主要材料和试剂
• 1.2 B.bovis LAMP方法的建立
• 1.3 B.BOVIS CYT B基因PCR检测方法的建立
• 1.4 LAMP特异性试验
• 1.5 LAMP敏感性试验
• 1.6 重复性试验
• 2 结果
• 2.1 反应体系的优化
• 2.2 特异性试验结果
• 2.3 敏感性试验结果
• 2.4 重复性试验结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 附录A 本研究被GenBank所收录的基因序列
• 附录B 英文缩写注释
• 攻读硕士期间发表或录用的学术论文
• 致谢