共生菌Wolbachia对褐飞虱生殖和适合度的影响及在其体内感染密度的动态研究

论文摘要

Wolbachia是广泛存在于节肢动物体内的共生细菌,可通过宿主卵的细胞质进行母系遗传给后代,并且能够通过不同的方法调控寄主的生殖以实现在宿主种群中的稳定存在和扩散。褐飞虱Nilaparvata lugens (Stal)是危害我国和亚洲一些国家及地区水稻的重要害虫,其周期性的北迁南返与降落危害给水稻生产造成了重大的损失。本实验室通过对我国的一些不同地理种群褐飞虱的检测发现,Wolbachia在褐飞虱的种群中广泛存在。本文以不同虫源地的三个地理种群的褐飞虱为实验材料,研究了共生菌Wolbachia对褐飞虱生殖和适合度的影响,并通过荧光定量PCR的方法研究褐飞虱不同发育阶段Wolbachia密度的感染动态以及不同组织中Wolbachia的分布情况。研究结果解释了共生菌Wolbachia在褐飞虱种群中的维持和扩散。此外,我们还试着探讨了Wolbachia在寄主体内的密度是怎样对寄主的生殖和适合度产生影响的。本研究为共生细菌与宿主间的协同进化、互惠共生等关系提供了基础资料,并为利用共生细菌对害虫进行种群控制提供理论依据。为了研究共生菌Wolbachia对褐飞虱生殖的影响,以海南三亚(HN),广西南宁(GX)和云南宁洱(YN)三个地理种群为实验材料。我们通过遗传杂交的方法检测了Wolbachia在这三个褐飞虱种群中诱导的胞质不亲和(CI)的强度以及后代的性比。研究发现,共生菌Wolbachia在这三个褐飞虱种群中均不能诱导CI,四种杂交组合的卵的孵化率之间没有显著差异,并且后代的性比也没有差异。对感染这三个褐飞虱种群的Wolbachia的序列进行测定,这三个种群感染的Wolbachia是同一个株系(wLug)。从褐飞虱的产卵量、寿命以及垂直传播效率三个方面来评估Wolbachia对褐飞虱适合度的影响。在海南种群中,感染Wolbachia的雌虫的产卵量要显著的高于未感染的雌虫,而云南和广西种群感染与不感染Wolbachia的雌虫的产卵量之间没有显著差异,海南种群是唯一一个发现Wolbachia的感染能够提高雌虫产卵量的种群。在寿命方面,海南种群感染Wolbachia褐飞虱成虫的寿命要显著的短于不感染品系的寿命,云南和广西种群感染与不感染Wolbachia的褐飞虱的寿命之间没有显著差异。为了检测Wolbachia在褐飞虱体内的密度,我们是使用定量PCR的方法对Wolbachia wsp基因的拷贝数进行了测定。检测了海南和广西种群褐飞虱五了龄期的若虫以及12个日龄(1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22)的成虫体内Wolbachiawsp基因的拷贝数。在若虫阶段,两个种群褐飞虱体内Wolbachia wsp基因的拷贝数随着若虫龄期的增长在逐渐的增大。而在成虫阶段,两个种群则不太一样,广西种群褐飞虱成虫体内的Wolbachia的密度随着日龄的增大而逐渐降低,海南种群总是时高时低的波动,但总体的趋势还是降低的。比较这两个种群感染的Wolbachia密度的差异,发现海南种群的要明显高于广西种群。以褐飞虱海南三亚种群为实验材料,运用实时荧光定量PCR的方法对感染Wolbachia品系的长翅雌虫、长翅雄虫、短翅雌虫和短翅雄虫体内Wolbachia的拷贝数进行测定,研究表明,雌虫中Wolbachia的密度一般都要高于雄虫,短翅雌虫中Wolbachia的密度要显著的高于长翅型雌虫。我们进一步将每一个虫体解剖为头部、胸部、腹部和足四个部分,对各个部分中的Wolbachia的含量进行了定量,研究Wolbachia在寄主各个组织中分布含量的差异。四个组织中,由于褐飞虱的生殖组织在腹部,而Wolbachia主要集中于寄主的生殖细胞中,所以腹部的Wolbachia含量最高。在非生殖组织中,我们也发现了Wolbachia的存在,胸部含量比头和足的含量都要高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 Wolbachia的研究进展
• 1.1 Wolbachia的形态与分布
• 1.1.1 Wolbachia的形态
• 1.1.2 Wolbachia的宿主范围
• 1.1.3 Wolbachia在宿主体内的分布
• 1.2 Wolbachia的系统分化
• 1.3 Wolbachia的传播
• 1.3.1 垂直传播
• 1.3.2 水平传播
• 1.4 Wolbachia对宿主生殖活动的调控
• 1.4.1 诱导胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility,CI）
• 1.4.2 诱导孤雌生殖（parthenogenesis inducing,PI）
• 1.4.3 诱导雌性化（feminization）
• 1.4.4 杀雄（male-killing）
• 1.5 Wolbachia对寄主适合度的影响
• 1.5.1 增强宿主的繁殖力
• 1.5.2 对宿主种群适合度的负面影响
• 1.6 Wolbachia的生物防治潜力
• 2 褐飞虱及其体内Wolbachia的研究进展
• 2.1 褐飞虱的分布与发生概况
• 2.1.1 褐飞虱的分布
• 2.1.2 褐飞虱的发生概况
• 2.2 褐飞虱的生物学特性
• 2.2.1 褐飞虱的取食与为害
• 2.2.2 褐飞虱成虫的交配与产卵行为
• 2.3 褐飞虱体内Wolbachia的研究概况
• 3 实时荧光定量PCR技术及其在共生菌研究领域的应用
• 3.1 实时荧光定量PCR原理
• 3.1.1 荧光染料法
• 3.1.2 探针法
• 3.2 实时荧光定量PCR的应用方法
• 3.2.1 绝对定量PCR（Absolute Quantification,AQ）
• 3.2.2 相对定量PCR（Relative Quantification,RQ）
• 3.3 实时荧光定量PCR技术在生命科学中的应用
• 3.4 实时荧光定量PCR技术在共生菌研究领域的应用
• 第二章 共生菌Wolbachia对褐飞虱生殖的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料及饲养方法
• 1.2 褐飞虱总DNA的提取
• 1.3 PCR检测褐飞虱体内的共生菌Wolbachia
• 1.4 对褐飞虱体内的共生菌Wolbachia进行序列测定
• 1.4.1 PCR产物的纯化
• 1.4.2 质粒载体的连接与转化
• 1.4.3 测序
• 1.5 筛选100%感染和100%不感染Wolbachia的褐飞虱品系
• 1.5.1 筛选100%感染Wolbachia的品系
• 1.5.2 筛选100%不感染Wolbachia的品系
• 1.6 遗传杂交实验
• 1.7 数据整理和分析
• 2 结果与分析
• 2.1 Wolbachia的wsp基因序列比较
• 2.2 不同杂交组合间孵化率比较
• 2.3 不同杂交组合间性比比较
• 3 讨论
• 3.1 不感染Wolbachia褐飞虱品系筛选方法的选抒
• 3.2 不诱导CI的Wolbachia（wLug）如何在褐飞虱种群中扩散
• 第三章 共生菌Wolbachia对褐飞虱适合度的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 产卵量和性比评估
• 1.3 寿命评估
• 1.4 垂直传播效率评估
• 1.5 数据整理和分析
• 2 结果与分析
• 2.1 Wolbachia对褐飞虱产卵量的影响
• 2.2 Wolbachia对褐飞虱性比的影响
• 2.3 Wolbachia对褐飞虱寿命的影响
• 2.4 Wolbachia在褐飞虱中的垂直传播效率
• 3 讨论
• 第四章 褐飞虱不同发育阶段体内Wolbachia密度的动态变化
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 褐飞虱总DNA的提取
• 1.3 PCR检测褐飞虱体内的Wolbachia
• 1.4 PCR产物的纯化
• 1.5 质粒载体的连接与转化
• 1.5.1 连接反应
• 1.5.2 转化反应
• 1.5.3 细菌培养
• 1.6 质粒的提取
• 1.7 实时定量PCR检测褐飞虱体内Wolbachia的密度
• 1.8 不同发育阶段褐飞虱的Wolbachia密度的测定
• 1.8.1 若虫阶段Wolbachia密度的测定
• 1.8.2 成虫阶段Wolbachia密度的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 Wolbachia wsp基因标准曲线的制定
• 2.2 广西南宁种群褐飞虱体内Wolbachia密度与日龄的关系
• 2.2.1 若虫阶段
• 2.2.2 成虫阶段
• 2.3 海南三亚种群褐飞虱体内Wolbachia密度与日龄的关系
• 2.3.1 若虫阶段
• 2.3.2 成虫阶段
• 2.4 广西种群与海南种群褐飞虱体内Wolbachia密度的比较
• 3 讨论
• 第五章 褐飞虱长短翅型成虫不同组织内Wolbachia的密度
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 褐飞虱不同翅型成虫体内Wolbachia的定量
• 1.3 褐飞虱的解剖及各组织内Wolbachia的定量
• 1.4 数据整理与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 褐飞虱长短翅型成虫体内Wolbachia的密度
• 2.2 Wolbachia在褐飞虱不同组织中分布的密度
• 2.3 褐飞虱长短翅型成虫及不同组织中Wolbachia的PCR扩增及鉴定
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 学术论文发表情况
• 致谢