新基因BRAP的克隆与功能研究

论文摘要

神经肽在气道高反应或气道炎症发生过程中的作用越来越引起重视。蛙皮素样肽（bombesin-like peptides BLPs）是一类具有广泛生物学功能的神经肽。在哺乳动物,目前已经确认的BLPs成员有胃泌素释放肽（GRP）和神经介素B（NMB）。与之对应,哺乳动物体内BLPs受体家族已确认3个成员,分别是GRP受体、NMB受体和蛙皮素受体亚型-3（bombesin receptor subtype 3, BRS-3）。前二者分别与GRP和NMB以高亲和力结合并引起相应生物学功能,而BRS-3的天然配体尚未确定,故属孤儿受体,蛙皮素受体亚型-3是由399个氨基酸组成的7次跨膜G蛋白偶联受体,在正常的大多数组织内表达很低,其生物学意义、生物学效应、基因表达调控目前不太清楚,而在发育中的肺组织及肿瘤组织中表达增高,提示BRS-3可能与细胞生长、损伤修复有关。本室前期研究发现,BRS-3在肺和气道上皮应激反应调节过程中可能发挥作用,并进一步对BRS-3的生物学功能、基因表达调控和BRS-3天然配体进行了一系列研究。细菌双杂交技术显示BRS-3可与多种蛋白发生相互作用,这些蛋白的功能分别与细胞的生长、分化、抗凋亡、细胞骨架、酪氨酸激酶等有关。免疫共沉淀同时发现两种可与BRS-3发生相互作用的新蛋白,其生物学意义不清楚。本课题针对其中一种与BRS-3相互作用的新基因（暂命名蛙皮素受体激活蛋白bombesin receptor activated protein BRAP,基因库序列号：NM-152734）的序列特征、生物信息学及其功能进行相关研究。目的：利用生物信息学技术,搜索克隆基因及预测基因功能等方法研究与蛙皮素受体亚型-3（Bombesin receptor subtype-3,BRS-3）相互作用的一个新基因BRAP的基本生物信息学特征,进一步观察BRAP表达蛋白的细胞亚定位以及在支气管上皮细胞中的功能,为研究BRAP与BRS-3在支气管上皮细胞应激反应中的超分子组装奠定基础。方法：（1）利用克隆基因分析软件对BRAP进行生物信息学分析。（2）利用RT-PCR扩增新基因BRAP的ORF,并克隆至pEGFP-C1载体,构建真核重组质粒pEGFP-C1/BRAP,转染Hela细胞,同时以空白细胞和空载体转染细胞作对照,经瞬时高效表达,在激光共聚焦显微镜下观察其表达产物的亚细胞定位。,以Western-blot法分析转染后蛋白表达情况。（3）构建真核重组质粒pcDNA3.1（+）／BRAP,瞬时转染人的支气管上皮细胞（Human bronchial epithelial cells,HBECs）,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响；筛选稳定表达pcDNA3.1（+）／BRAP HBEs株,观察BRAP新基因对支气管上皮细胞损伤修复的影响。损伤修复测定采用在融合的支气管上皮细胞单层上造成一小面积不规则缺损,用显微视频分析系统每隔4h测量缺损面积一次,绘制时间与修复面积的直线回归方程,直线的斜率的绝对值为损伤修复指数,斜率越大,损伤修复速度越快。结果：（1）BRAP cDNA全长6721bp,编码354个氨基酸,精确定位于6p21.2,并在正常胎儿脑组织、胎肺、胎肝、人胚干细胞、脑星形细胞瘤、前列腺癌、肺癌等组织中高表达,蛋白结构预测显示该基因有跨膜区域。（2）构建真核重组质粒pEGFP-C1／BRAP,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与GENE BANK数据库的序列一致,荧光标记蛋白亚细胞定位结果显示其表达产物定位于胞膜和胞浆,在转染重组子的细胞中其蛋白的表达明显上调。（3）构建真核重组质粒pcDNA3.1（+）／BRAP,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与GENE BANK数据库的序列一致；流式结果提示重组质粒pcDNA3.1（+）／BRAP对细胞周期的S期+G2提高25%；并促进了HBECs的损伤修复的能力。结论：（1）生物信息学分析结果提示提示BRAP具有信号分子特性,可能参与细胞生理功能的调控。（2）该基因表达蛋白亚细胞定位于胞膜和胞浆,提示该蛋白可能是胞浆蛋白,参与细胞信号转导。（3）BRAP在HBECs高表达后促进HBECs细胞分裂周期,提高HBECs损伤修复能力。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 前言
• 第一章 BRAP的生物信息学分析
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第二章 BRAP克窿及表达蛋白亚细胞定位
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 第三章 BRAP过表达对支气管上皮细胞功能的影响
• 3 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 综述
• 参考文献
• 致谢