Asia1型FMDV前导蛋白的BHK-21亚细胞定位及其所致细胞蛋白质组变化研究

论文摘要

口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV）属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属,为大约8500 nt的单股正链RNA病毒。FMDV感染宿主后,病毒RNA被翻译成一个多聚蛋白,经前导蛋白(leader protein, Lpro)、2A、3C裂解为若干结构蛋白和非结构蛋白。Lpro是FMDV编码的第一个蛋白质,为FMDV重要的毒力因子之一,其主要功能是通过降解转录起始因子NF-κB抑制宿主细胞的转录系统,降解宿主细胞翻译起始因子eIF4G而关闭宿主细胞“帽子”依赖的mRNA翻译,抑制I型干扰素及MHC-1的合成从而降低机体对FMDV的天然免疫应答,同时激活宿主细胞凋亡相关蛋白。大部分蛋白质功能的发挥与其亚细胞定位密切相关,目前,有关Lpro亚细胞定位的研究主要是通过细胞固定的免疫荧光实验进行的,实际上大量研究表明,应用化学试剂透膜可导致细胞内蛋白定位的改变。绿色荧光蛋白（GFP）及其类似物与其他蛋白融合通常不改变靶蛋白的细胞定位和功能,因此,利用融合荧光蛋白的方法确定Lpro在活细胞内的确切定位对其功能的认识具有重要意义。本研究构建了Asia1型FMDV Lpro基因的真核表达载体pEGFP-Lpro,瞬时转染BHK-21细胞,借助共聚焦显微分析了Lpro在BHK-21细胞内的定位情况;结果发现Lpro在细胞核与细胞质中均有分布,说明Lpro可能存在着潜在的核定位信号（NLS）,通过核定位信号运送至细胞核内直接或间接的参与了NF-κB的降解或行驶其它功能。目前,对Lpro功能研究仅限于基因组学和转录组学水平,但是,很多病毒蛋白只影响细胞内蛋白的修饰和周转,而不影响对应基因的转录及mRNA加工,因此只从基因组或转录组水平上研究病毒蛋白与宿主细胞之间相互作用机制有一定的局限性。为分析Asia1型FMDV Lpro致细胞蛋白质变化特征,本研究构建了真核表达载体pCDNA-Lpro,瞬时转染BHK-21细胞,确认Lpro的表达后,利用2-DE技术对转染和未转染pCDNA-Lpro的BHK-21细胞样品进行了差异蛋白质组学分析。结果显示,在转染的BHK-21细胞样品中共有21个蛋白质点发生了上调或下调的差异变化,经基质辅助的激光解吸离子-吸附飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）鉴定为21种蛋白,包括10个上调蛋白和11个下调蛋白,分析结果显示这些差异表达蛋白与细胞骨架、RNA编辑,蛋白质加工、氨基酸代谢、核小体组装、信号转导等功能有关。根据差异蛋白的注释结果推测细胞骨架相关蛋白、细胞核相关蛋白的下调表达可能与Lpro抑制宿主细胞的转录,翻译系统有关。Endophilin-B1的上调表达和Peroxiredoxin-2的下调表达可能是Lpro诱导细胞凋亡的机制之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 蛋白质组学及其在动物医学中的应用
• 1.1 蛋白组组学常用技术
• 1.1.1 蛋白质的分离技术
• 1.1.2 蛋白质的鉴定技术
• 1.1.3 生物信息学
• 1.1.4 蛋白质组学研究策略
• 1.2 蛋白质组学在动物医学中的应用研究进展
• 1.2.1 蛋白质组学在动物细菌性疾病研究中的应用
• 1.2.2 蛋白质组学在动物病毒性疾病研究中的应用
• 1.2.3 蛋白质组学在动物寄生虫病研究中的应用
• 1.2.4 蛋白质组学在动物其他疾病及相关领域研究中的应用
• 1.2.5 展望
• pro)功能研究进展'>第二章 口蹄疫病毒前导白蛋(L^pro)功能研究进展
• pro 的结构特征及活性区域'>2.1 L^pro的结构特征及活性区域
• pro 对宿主蛋白质翻译的影响'>2.2 L^pro对宿主蛋白质翻译的影响
• pro 是FMDV 主要毒力决定因子之一'>2.3 L^pro 是FMDV 主要毒力决定因子之一
• pro 抑制宿主天然免疫应答'>2.4 L^pro抑制宿主天然免疫应答
• pro 与细胞凋亡'>2.5 L^pro与细胞凋亡
• pro 的亚细胞定位特征'>2.6 L^pro的亚细胞定位特征
• 2.7 展望
• 第三章 亚洲1 型FMDV 前导蛋白亚细胞定位
• 前言
• 3.1 材料
• 3.1.1 病毒、菌株、细胞、载体
• 3.1.2 工具酶及要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 培养基及抗生素的配置
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物的设计与合成
• 3.2.2 病毒RNA 提取
• 3.2.3 目的基因的RT-PCR 扩增
• 3.2.4 PCR 产物回收
• 3.2.5 目的基因与载体的双酶切
• 3.2.6 目的基因与真核表达载体的连接
• 3.2.7 连接产物的转化
• 3.2.8 重组质粒的提取
• 3.2.9 重组质粒的酶切及PCR 鉴定
• 3.2.10 重组质粒的大量提取及浓度测定
• 3.2.11 转染
• 3.2.12 表达产物的荧光检测
• 3.2.13 表达产物的western-blot 分析
• 3.2.14 PI 核染及亚细胞定位观察
• 3.3 结果
• pro 基因的RT-PCR 扩增'>3.3.1 L^pro 基因的RT-PCR 扩增
• pro 重组质粒的鉴定'>3.3.2 pEGFPN-L^pro重组质粒的鉴定
• 3.3.3 重组蛋白的荧光检测
• 3.3.4 western blot 分析
• pro 的亚细胞定位'>3.3.5 L^pro的亚细胞定位
• 3.4 讨论
• 第四章 Asia1 型FMDV 前导蛋白致BHK-21 蛋白质组变化研究
• 前言
• 4.1 材料
• 4.1.1 病毒、菌株、细胞、载体
• 4.1.2 工具酶及要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 目的基因与载体的双酶切
• 4.2.2 目的基因与真核表达载体的连接
• 4.2.3 重组质粒的鉴定
• 4.2.4 重组质粒的大量提取
• 4.2.5 转染及样品制备
• 4.2.6 表达产物的RT-PCR 检测
• 4.2.7 表达产物的Western blot 分析
• 4.2.8 第一向IEF
• 4.2.9 第二向SDS-PAGE
• 4.2.10 凝胶染色
• 4.2.11 图像扫描和分析
• 4.2.12 胶内酶切与质谱鉴定
• 4.2.13 鉴定蛋白的生物信息学分析
• 4.3 结果
• pro 的鉴定'>4.3.1 重组质粒pCDNA-L^pro的鉴定
• 4.3.2 表达产物的RT-PCR 检测
• 4.3.3 western blot 分析
• 4.3.4 2-DE 图谱
• 4.3.5 2-DE 图谱分析
• 4.3.6 蛋白鉴定
• 4.3.7 鉴定蛋白的注释及生物信息学分析
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 硕士期间文章发表情况
• 导师简介