论文摘要
目的: 本研究拟构建编码结核分枝杆菌 H37Rv Ag85B DNA 疫苗,一方面将该疫苗经小鼠鼻粘膜免疫,探讨其在小鼠体内诱导的免疫应答及机制;另一方面研究在 BCG初免后,将该疫苗滴鼻免疫进行增强免疫所诱导的免疫应答及机理。以上设计试图为结核病疫苗寻找最佳免疫途径和方案,为结核病的粘膜免疫防治提供理论和实验依据。 方法: 1、用 PCR 和基因克隆技术构建真核表达质粒 pcD85B,Ag85B 编码基因亚克隆 入原核表达质粒 pET32a 中, 纯化重组的 Ag85B 蛋白,制备 Ag85B 抗血清; pcD3.1（+）、pcD85B、转染 COS-7 细胞,用 RT-PCR、ELISA 和斑点印迹的方 法鉴定目的基因的表达;pcD3.1（+）、pcD85B 免疫 C57BL/6 小鼠,ELISA 法 测量免疫后相应的 PPD 特异性抗体和脾淋巴细胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水 平,MTT 法检测 PPD 特异性脾淋巴细胞增殖能力,评价 DNA 疫苗的免疫原性。 2、将 PBS、pcD3.1、pcD85B（滴鼻时溶于 PBS 或者以脂质体包裹）分别以肌 注和滴鼻免疫 C57BL/6 小鼠,采用 ELISA 法测量免疫后相应的 PPD 特异性 抗体和脾淋巴细胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水平; CTL 试验评估小鼠 CD8+T 细胞的杀伤活性。 3、C57BL/6 小鼠分三组,一组皮下接种 BCG,另外两组在 BCG 接种 14 周后, 分别以脂质体包裹的 pcD3.1、pcD85B 滴鼻进行增强免疫;采用 ELISA 法测 量免疫后相应的 PPD 特异性抗体和脾淋巴细胞 IL-4 以及 IFN-γ分泌水平; CTL 试验评估小鼠 CD8+T 细胞的杀伤活性。 结果:1、 经过限制性内切酶酶切及DNA双向测序证实pcD85B真核表达质粒构建成 功;用重组的 Ag85B 蛋白制备的鼠抗 Ag85B 血清效价为 1:64;重组质粒 4转染 COS-7 细胞后, Ag85B 多克隆抗体通过 ELISA 法检测到细胞培养上清液 Ag85B 的表达,对照组为为阴性反应;pcD85B 免疫 C57BL/6 小鼠, 末次免疫后 4 周各组 PPD 特异性抗体水平均有不同程度增高,脾淋巴细胞PPD 特异性 IFN-γ分泌水平以及脾淋巴细胞增殖能力均增高。2、 脂质体包裹的 pcD85B 滴鼻途径①可诱导局部粘膜免疫 BALF 中的 sIgA 抗体滴度最高（P<0.05）,但血清中 IgA 的抗体滴度不高;②可诱导产生 Th1型细胞免疫。该组 IFN-γ水平较高,与同样用脂质体包裹的载体对照比,有显著差异（P<0.05）,与肌注组无显著差异（P>0.05）,低于 BCG 组（P<0.05）。溶于 PBS 的 DNA 疫苗组 IFN-γ水平非常低,低于载体对照组、肌注组和 BCG 组（P<0.05）。该组 IL-4 水平很低,与肌注组、阳性对照BCG 组、以及生理盐水 DNA 滴鼻组相比,都有显著差异（P<0.05）。该试验组 IgG2a 抗体滴度较高,和肌注组、阳性对照 BCG 组相比无显著差异（P>0.05）;与生理盐水 DNA 滴鼻组有显著差异（P<0.05）。③体液免疫较弱 血清 IgG 抗体水平低于肌注组和 BCG 组。④CTL 试验 通过不同组别颗粒酯酶分泌百分率（%）来反映细胞毒性 T 细胞的功能。该指标在不同免疫途径区别不大,除与 PBS 对照有区别外,与载体对照差别甚微。3、 BCG 皮下初免,pcD85B 滴鼻增强的方案强于单纯 BCG 皮下免疫对照组,表现在①粘膜免疫 它的 BALF 中的 sIgA 抗体滴度高于 BCG 组（P<0.05）。②体液免疫 该组的特异性 IgG 抗体滴度略低于 BCG 组 ③Th1 型细胞免疫检测 PPD 刺激的脾淋巴细胞培养上清,其 IFN-γ 水平稍低于 BCG 组,但明显高于 pcD85B 肌注组;IL-4 水平明显低于 BCG 组和肌注组,特异性 IgG2a的抗体滴度高于 BCG 组（P<0.05）。④细胞杀伤活性 通过不同组别颗粒酯酶分泌百分率（%）来反映细胞毒性 T 细胞的功能。该组颗粒酯酶分泌百分率 86.3946%,低于 BCG 组的 93.3333%。结论:1、 pcD85B 疫苗构建成功, 能在 COS-7 细胞中分泌表达,可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。2、 脂质体包裹的 DNA 疫苗组与同等剂量的肌注组产生的系统免疫差别不大,弱于 BCG 组;溶于 PBS 的 DNA 疫苗组弱于同等剂量的脂质体组和肌注组,也弱于 BCG 组;DNA 疫苗可以进行滴鼻尝试。
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