甜菜生殖相关基因的克隆

论文摘要

高等植物生活史是有性世代与无性世代更迭出现的生殖方式。植物的早期胚胎发育是伴随着细胞分裂而进行的,所涉及的重要生物学过程包括合子激活、极性建立、形态建成、和器官发生等。植物胚胎发育是非常复杂的,不是由单一基因单独作用的,而是由多基因控制的过程。绪论部分中按植物胚胎发生的各个时期对这些基因及其表达特点作了详细综述。本实验是以甜菜(Beta vulgaris)M14品系为材料,克隆与生殖发育有重要关系的基因。我们选择甜菜作为实验对象不仅仅因为甜菜在我国广泛栽培。具有可观的经济价值,更重要的是人们在甜菜的长期培育过程中获得了若干宝贵的亚种,积累了人量遗传信息。我们选择的M14品系在细胞胚胎学和遗传学特征上具有鲜明的无融合生殖现象。本研究通过采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE)的方法,根据现有其他物种的MARB,CK2基因的同源序列,设计简并引物,应用3’RACE扩增出cDNA的3’端序列,通过5’RACE扩增5’端序列,得到了甜菜CK2完整的编码序列为1002bp,编码333个氨基酸。同源比对表明,甜菜CK2与水稻CK2同源性为61.05%,与玉米CK2的同源性为61.07%,与拟南芥CK2的同源性为62.07%,与烟草CK2的同源性为64.22%,与百合CK2的同源性为65.18%。MARB完整的编码序列为1719bp,编码572个氨基酸。同源比对表明,甜菜MARB与拟南芥MARB的同源性为57.19%,与番茄MARB的同源性为61.26%,与烟草MARB的同源性为67.20%。为了克服基因表达丰度低的问题,应加大cDNA模板的使用量,并优化PCR体系,尤其是以高质量cDNA为模板,适当提高退火温度,反复多次实验。对于低丰度表达的其它基因应继续实验,对于多基因互作的现象做进一步的证实和研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 详细摘要
• 第1章 绪论
• 1.1 高等植物生殖调控相关基因的研究进展
• 1.1.1 生殖细胞分化和配子体发生
• 1.1.2 受精作用
• 1.1.3 合子激活
• 1.1.4 极性建立
• 1.1.5 形态建成
• 1.1.6 胚分生组织形成
• 1.1.7 植物蛋白激酶
• 1.2 无融合生殖简介
• 1.3 蛋白激酶CK2
• 1.4 MAR 序列结合蛋白
• 1.4.1 核基质与核基质结合区
• 1.4.2 MAR 序列结合蛋白
• 1.5 SMART RACE 扩增技术
• 1.5.1 SMART cDNA 合成的机制
• 1.5.2 SMART RACE 机制的流程
• 1.6 课题研究的目的和意义
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 酶及试剂盒等
• 2.1.4 主要溶液配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 采样植物材料的处理
• 2.2.2 总RNA 的提取和检测
• 2.2.3 目的基因片段RT-PCR
• 2.2.4 3’RACE 法克隆目的基因3’端区段
• 2.2.5 5’RACE 法克隆基因的5’端区段
• 2.2.6 序列拼接及RT-PCR 验证
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 总RNA 的提取
• 3.2 目的基因片段RT-PCR
• 3.3 3’RACE、5’RACE 及序列拼接
• 3.4 全长序列的验证及序列测定
• 3.4.1 RT-PCR 验证及酶切验证
• 3.4.2 全长cDNA 的序列测定
• 3.5 分析与讨论
• 3.5.1 核酸序列分析
• 3.5.2 核酸序列ORF 查找及氨基酸序列推导
• 3.5.3 氨基酸序列分析及细胞内定位预测
• 3.5.4 RNA 提取
• 3.5.5 RACE 方法的使用
• 3.5.6 引物设计的原则和技巧
• 3.5.7 PCR 体系的优化
• 3.5.8 生殖相关基因的表达不稳定
• 3.5.9 进一步的研究方向
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢