论文摘要
研究背景和目的随着社会的发展,生活水平的提高,以及人口老龄化,糖尿病患病率在全球范围内呈快速上升趋势,成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的第三大非传染疾病,对人类健康构成了极大的威胁,给个人和社会带来了极重的负担,已经成为严重危害人类健康的世界性公共卫生问题。据世界卫生组织估计,全球糖尿病患者人数将从2003年的1.94亿上升到2030年的3.6亿,由于中国庞大的人口基数,使中国背负着极大的糖尿病负担,糖尿病人群数量占据全球的1/3,近期调查结果显示,在20岁以上的成人中,年龄标化的糖尿病的患病率为9.7%,而糖尿病前期的比例更高达15.5%,相当于每十个成年人中就有一名糖尿病患者,每四个成年人中就有一个高血糖状态者。在中国糖尿病人群中,90%为Ⅱ型糖尿病。中国Ⅱ型糖尿病防治指南多次明确提出,目前我国Ⅱ型糖尿病防治面临的主要挑战和任务之一,就是降低Ⅱ型糖尿病发病率,对Ⅱ型糖尿病进行早期干预。Ⅱ型糖尿病早期共同的特点是糖耐量减低（impaired glucose tolerance,IGT）和/或空腹血糖受损（Impaired fasting glucose, IFG）。IGT/IFG是介于正常血糖与DM之间的一种糖代谢异常,是Ⅱ型糖尿病自然病程中一个阶段。胰岛素（Ins）抵抗（IR）和Ins分泌缺陷是IGT/IFG的主要原因,其中,IGT主要与Ins分泌缺陷有关,而IFG主要与IR有关。国内IGT/IFG的患病率高达4.76%,每年约有10%-15%的IGT/IFG转变为T2DM。IGT/IFG患者虽无临床DM症象,但可进展为T2DM,而且,这一时期可导致动脉粥样硬化、高血压、冠心病等心血管并发症。因此,加强IGT/IFG防治是降低T2DM发病率及心血管并发症的重要环节。研究认为,氧化应激时体内活性氧（reactive oxygen soecies, ROS）生成增多,ROS通过脂质过氧化损伤、断链DNA,抑制ATP合成及趋化作用等不同方式损伤胰岛β细胞,诱发胰岛素抵抗,是导致IGT的重要因素。而胰岛β细胞本身对ROS的清除能力较低,容易受到ROS的损伤,引起细胞坏死或凋亡,导致胰岛素的分泌缺失。此外,机体ROS活性增高时,影响胰岛素与其受体的结合,并导致下游信号转导发生异常,引起胰岛素抵抗。因此,可通过改变机体的ROS水平,进而改善胰岛素抵抗和保护胰岛β细胞功能。肠促胰岛素是进食后肠道分泌的一种激素。研究显示口服葡萄糖较静脉注射等量葡萄糖更能刺激胰岛素分泌,此即通过肠促胰岛素发挥效应。肠促胰岛素的主要活性成分是胰高血糖素样肽（GLP）-1。GLP-1受体（GLP-1R）被激活可刺激胰岛素分泌,同时抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空以及降低食欲等。GLP-1的分解是通过二肽基肽酶-4（DPP-4）实现的,抑制DPP-4即可提高GLP-1而起降糖作用。石参（Uraria crinita）是豆科狸尾豆属的多年生直立亚灌木植物,主要分布于我国南方沿海省份,包括广东（猫尾草）、广西（虎尾轮）、海南（猫尾射）、福建、台湾。从2008年开始,本实验室对石参进行了一系列研究,表明石参水提液能通过改善OGTT,降低空腹血糖水平而具备改善IGT和IFG作用。这一作用与降低血浆游离脂肪酸（FFA）和甘油三酯（TG）有关,也与促进Ins释放有关。为此,本实验在前期研究的基础上,拟对石参中黄酮类组分进行提取分离,通过DPPH,ABTS等实验评价石参中黄酮的总抗氧化能力,并用体外实验研究石参中黄酮对羟基自由基、超氧阴离子、H2O2、NO等自由基的清除能力以及对脂质过氧化的保护能力。同时,通过对胰岛瘤细胞的几种氧化应激模型的保护作用研究及相关指标的检测,探讨石参在糖尿病氧化应激过程中的保护作用以及相关机理。并探索石参总黄酮对DPP-Ⅳ酶的抑制活性。方法1、石参所含化学成分的鉴别以蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯为溶剂,利用索氏提取器对石参进行抽提,对所得水提液、醇提液和乙酸乙酯提取液进行化学颜色反应鉴别,验证该三类提取液中生物碱、皂苷、黄酮、蒽醌、香豆素、酚性化合物、多糖等化学物质的存在与否。2、石参中总黄酮的提取分离经粉碎的石参,按1：10（g.mL-1）料液比加入50%乙醇溶液,冷凝回流提取,过滤,滤液减压浓缩至近干,将浓缩物溶于水中,过滤,滤液用乙醚萃取,母液再用乙酸乙酯萃取,回收乙酸乙酯部分,减压浓缩,最后进行冷冻干燥,即得石参总黄酮。3、石参总黄酮体外抗氧化研究根据芦丁标准曲线,配制总黄酮含量为0.1、0.08、0.06、0.04、0.02mg/ml的药物溶液,以相同浓度的维生素C或维生素E为对照,通过紫外-可见分光光度计,检测石参总黄酮对DPPH （517 nm）, ABTS+ （734nm）,NO （540nm）,·OH （536nm）以及脂质过氧化（500nm）的抑制活性4、INS-1E细胞氧化应激及石参总黄酮的保护作用指数生长期的INS-1E细胞接种于96孔板（1×104/孔）,用不同浓度的提取物溶液处理（含总黄酮终浓度为0.03、0.02、0.01、0.005、0.001mg/ml）后,模型组与给药组一起用H2O2（0.4mmol/L）或亚硝基铁氰化钠SNP（10mmol/L）进行氧化损伤处理,然后用MTT法在570nm波长处检测胰岛细胞氧化应激后存活率。5、石参总黄酮对INS-1E细胞氧化应激状态下NO、NDA、GSH含量和SOD活性的影响指数生长期的INS-1E细胞接种于24孔板（1×105/孔）,用不同浓度的提取物溶液处理（含总黄酮终浓度为0.03、0.02、0.01、0.005、0.001mg/ml）后,模型组与给药组一起用H2O2（0.4mmol/L）或亚硝基铁氰化钠SNP（10mmol/L）进行氧化损伤处理。收集细胞培养上清液和细胞破碎液,用相关试剂盒检测NO、MDA、GSH含量和SOD活性。6、DPP-Ⅳ抑制剂体外筛选模型的构建体外培养Caco-2细胞,破碎后提取DPP-Ⅳ酶,以Gly-Pro-pNA为底物（100umol/L）,根据DPP-Ⅳ切割底物的产物对硝基苯胺在405nm处有吸收,而检测DPP-Ⅳ酶的活性。将不同浓度的DPP-Ⅳ酶（10%,20%,25%,50%,75%,90%,100%）与底物反应,37℃孵育1h后,405nm检测OD值,以OD值为纵坐标,酶相对浓度为横坐标作标准曲线。同时用相对浓度100%的DPP-Ⅳ溶液与各不同浓度的sitagliptin溶液（0,1,10,20,100,500,1000 nnM）作用后与底物反应,37℃孵育1h后,405nm检测OD值,计算sitagliptin IC50。7、sitagliptin类似物以及石参总黄酮提取物对DPP-Ⅳ活性的抑制作用用相对浓度100%的DPP-Ⅳ溶液与各不同浓度的JD-1 （0,2500,2800,3000,3200,3500,4000 nM）、JD-2 （0,600,1000,1400,1800,2200,2600 nM）、石参总黄酮（0.03,0.02,0.01,0.005,0.001mg/ml）溶液作用后与底物反应,37℃孵育1h后,405nm检测OD值,并计算IC50。结果1、化学成分鉴定结果表明,在乙酸乙酯提取液中,含有黄酮类、蒽醌类、香豆素类等活性物质；在乙醇提取液中含有生物碱、皂苷、黄酮、蒽醌、香豆素、酚性化合物、多糖等活性物质；水提液中含有皂苷、黄酮、酚性化合物、多糖等活性物质。2、石参总黄酮体外抗氧化实验显示,石参总黄酮在20mg.L-1～100mg.L-1范围内,对DPPH, ABTS+, OH,NO等自由基具有明显的清除作用,最大清除率分别达到60.89%±0.19%,74.87%±0.08%,41.77%±0.41%,81.01%±9.61%,对脂质过氧化亦有明显的抑制作用,最大可达41.07%±0.10%,并具有浓度依赖性。3.石参总黄酮对INS-IE细胞氧化应激及的保护作用研究显示,H2O2（0.4mmol/L）和SNP （10mmol/L）对INS-1E细胞有显著损伤作用（P<0.01）,不同浓度石参总黄酮组的细胞存活率均高于氧化损伤组,但在H202损伤模型中,只有黄酮浓度在0.05和0.1mg/ml时,与模型组细胞存活率差异才有显著性（P<0.01）；在SNP损伤模型中,黄酮浓度在0.05-0.3mg/ml范围各组均与模型组有显著性差异（P<0.01）。4、石参总黄酮对INS-1E细胞氧化应激状态下NO、MDA、GSH含量和SOD活性的影响,H202和SNP损伤模型组NO、MDA、GSH含量和SOD活性与空白组出现显著性差异。石参总黄酮对INS-1E细胞的氧化应激有一定的保护作用,能在一定程度上调节NO、MDA、GSH含量和SOD活性。5、通过对已上市药品sitagliptinIC50测定,其IC50为18.6594 nM,与文献报道的18相接近,并求得sitagliptin类似物JD-1, JD-2的IC50分别为3416.5 nM和2641nM。石参总黄酮对DPP-IV酶无抑制效果。结论石参中富含抗氧化活性物质,其总黄酮具有清除自由基活性,对DPPH, ABTS, OH,NO等自由基具有明显的清除作用,对脂质过氧化亦有明显的抑制作用。同时,对胰岛β细胞氧化应激具有明显的保护作用,能改善氧化应激状态下细胞NO、MDA、GSH含量和SOD活性。但并无DPP-Ⅳ酶抑制活性。本研究的创新之处1、在本实验室对石参研究成果的基础上,首次提出用石参中具体抗氧化成分（总黄酮）进行抗氧化研究及对胰岛β细胞氧化损伤的保护作用的研究。首次将石参药效研究与糖尿病抗氧化治疗研究相结合。2、对石参抗糖尿病机理做出了大胆假设与尝试,并对总黄酮提取物进行DPP-Ⅳ抑制活性研究。