家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因的功能研究

论文摘要

谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione S-transferase,GSTs,EC 2.5.1.18）是一个多功能的超家族酶类,广泛分布于好氧生物体中。1961年,Booth等首次在大鼠肝脏中发现了谷胱甘肽-S-转移酶的存在,并推测该酶在药物的解毒代谢过程中起着重要作用。GSTs的主要功能是催化谷胱甘肽的巯基与有毒亲电子类物质轭合反应,以达到解毒的目的。此外,GSTs还可以作为配体结合蛋白以俘获有毒物质,行使解毒的功能。GSTs在昆虫对有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中起着重要的作用。而且,由于GSTs具有硒非依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶活性可以弥补昆虫缺乏硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶的不足,在抗氧化的过程中也显得非常的重要。因此,对昆虫GSTs功能的研究主要集中于其在杀虫剂抗性与抗氧化中所起的作用。目前,昆虫GSTs分为Delta、Epsilon、Omega、Theta、Sigma和Zeta六个已知的家族,另外一些不能被划分到已知家族的GSTs暂归为unclassified,其中与杀虫剂抗性相关的主要为昆虫特异的Delta和Epsilon家族的GSTs。家蚕是一种重要的经济昆虫,对杀虫剂非常敏感,极易受到杀虫剂的危害而导致蚕桑生产业遭受重大经济损失。另外,约70%的农林害虫属于鳞翅目,家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,是目前唯一完成了基因组测序的鳞翅目昆虫。因此,从生理学水平、基因组水平对家蚕GST基因功能进行研究,不仅能为家蚕抗性品系的育成提供理论依据,也可为开展鳞翅目昆虫的生物防治奠定基础。本研究获得的主要结果如下:1.家蚕GSTs相关的生理学研究酶的生理学特性是其基因功能的重要表现之一,为此,首先对GSTs在家蚕各组织、各发育时期的活性等生理学特性进行了分析。以CDNB为底物,对家蚕大造品系5龄第3天的9个组织的GSTs活性测定表明,在所测组织中均有GSTs活性。其中,头部的比活力最高,其次是脂肪体和中肠。脂肪体的Km（CDNB）值大于中肠,表明脂肪体GSTs对CDNB的亲和力小于中肠;而脂肪体的Vmax（CDNB）大于中肠,表明脂肪体GSTs的催化效率高于中肠。但有趣的是,家蚕头部GSTs对CDNB的亲和力和催化效率均高于中肠和脂肪体。以枯烯过氧化氢（CHP）为底物,发现9个组织中均有硒非依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶活性。与CDNB不同的是,马氏管、卵巢、精巢和丝腺中的GSTs对CHP的比活力相对较高。生殖腺具有较高的过氧化物酶活性,我们推测这可能在防止活性氧物质对生殖细胞造成损伤中起重要作用。在家蚕各发育时期（卵——幼虫——蛹——蛾）,GSTs活性呈现一定的规律性变化。在整个发育时期都能检测到GSTs对CDNB的活性,其中卵期的比活力最低,蚁蚕期出现一个活性小高峰,5龄第3天GSTs的比活力达到最高。第2天蛹的活性为34.505±2.285 nmol/（mg pro·min）,显著高于高于5龄起蚕的27.335±2.111 nmol/（mg pro·min）;第1天蛾的活性与5龄起蚕相似,不存在显著性差异。以LC50的辛硫磷处理5龄第3天的大造后,蚕体内发生了显著的氧化应激反应。对反映氧化应激水平的生物标记物——丙二醛的含量测定表明,辛硫磷处理后12h,脂肪体中诱导产生的MDA含量达到最高峰,是对照的4.11倍;12h后,MDA开始下降,到24h与对照基本一致。中肠组织中,36h处理与对照的MDA含量比率达到最大值（3.156）,48h后中肠MDA含量恢复到正常水平。辛硫磷处理20h后,脂肪体中的GSTs的表达即受到一定程度的诱导,GSTs对CDNB和枯烯过氧化氢（CHP）的活性显著增加,分别在42h和48h酶活性恢复到正常水平;而在中肠组织中,GSTs对CDNB和CHP的活性分别在20h和16h显著增加,分别在24h和30h恢复到正常水平。因此,辛硫磷处理家蚕后能诱导GSTs活性的增强,而且增加的GSTs活性可能在缓解氧化应激反应起重要作用。2.家蚕GST基因的生物信息学分析通过对家蚕全基因组的分析,共鉴定出23个胞质谷胱甘肽-S-转移酶基因,基因数目上与双翅目昆虫较为接近,而远远超过蜜蜂的GST基因数（8个基因）。昆虫特异的Delta和Epsilon两个家族在家蚕中也有显著扩增的现象,分别有4和8个基因。另外,Omega家族也有大量的扩增,共鉴定出4个基因。与其他昆虫类似,家蚕GST基因在基因组中有呈簇分布的特征。但Epsilon家族的8个基因中,仅e1、e4和e5三个基因串联分布在一起,其他的基因却散布于基因组中,这暗示着其重复机制的不同。相对于双翅目昆虫GSTs而言,家蚕GST基因的内含子数目较多,长度也较长。对家蚕GST基因的一些长内含子分析发现,其间存在数目众多的转座子序列。因此,我们推测这可能是由于家蚕基因组中存在大量的转座子或其残余等重复序列而使家蚕的GST基因内含子数目增多和长度增加。3.家蚕GST基因的表达模式与克隆ESTs数据分析表明,除BmGSTe2、BmGSTe6、BmGSTe8和BmGSTo4四个基因外,其他基因均有ESTs证据,并且在家蚕“卵——幼虫——蛹——蛾”的整个发育时期都有GST基因的表达。不同家族的GST基因ESTs数目及组织分布存在较大的差异,这些差异可能反映出了它们在家蚕的发育和在有毒物质的解毒过程中起着不同的作用。以GST基因在“熟蚕——蛾”发育时期的表达谱芯片进行聚类,聚类图分为高表达和低表达/不表达两大类群。高表达的基因中有4个为Delta和Epsilon家族的GSTs,其中BmGSTd3和BmGSTe5在发育时期和雌雄间均表现出了明显的差异。其他高表达基因为非昆虫特异的GSTs,它们在“熟蚕——蛾”时期几乎都有表达,而且雌雄间表达量大致相似。大部分低表达或不表达的基因为昆虫特异的GSTs,其在雌雄间的表达量也存在一定的差异。ESTs和芯片数据结果表明,昆虫特异的GSTs在发育时期和雌雄间的表达存在一定差异,可能与其功能相关。RT-PCR结果表明,23个家蚕GST基因都有表达。非昆虫特异的家族几乎在所有分析的8个组织中都有表达,而且表达量较高。相反,大部分昆虫特异的家族以及未分类的（unclassified）GST基因表现出了较强的组织特异性,特别是BmGSTe2和BmGSTe6基因仅在中肠中有表达,且表达量较低。大部分的Delta和Epsilon GSTs在中肠和脂肪体中表达量较低或不表达,这可能是家蚕对杀虫剂敏感的原因之一。以LC50的辛硫磷处理家蚕后,用RT-PCR和定量PCR方法检测到BmGSTe8在处理后24、30、36和42h其表达量显著上调,表明BmGSTe8在氧化应激反应中能被诱导表达,并可能在这一过程中起重要作用。另外,我们以RT-PCR方法对家蚕的12个GST基因进行了克隆,获得了其完整的CDS。4.杀虫剂对家蚕汰选后GSTs的表达变化辛硫磷和甲氰菊酯对家蚕19-440品系分别汰选5代和4代后,LD50分别是F0（未筛选的19-440品系）的1.78和4.18倍。相对而言,甲氰菊酯对家蚕选择后抗性发展速度较快。辛硫磷对家蚕汰选5代（F5）后,脂肪体中的GSTs对CDNB和CHP的比活力在雌雄中都有显著的增加;在雌雄的中肠组织中GSTs对CHP的比活力也均有显著的增加,而以CDNB为底物时,仅雌性家蚕GSTs的比活力有显著的诱导。甲氰菊酯对19-440汰选4代（F4）后,雌雄脂肪体中的GSTs对CDNB的比活力也都有显著的增加,分别是对照（F0）的1.13和1.20倍;中肠的GSTs对CHP的活性也有显著增加。2种杀虫剂对家蚕汰选后脂肪体和中肠GSTs的Km（CDNB）基本保持不变,Vmax（CDNB）的值与酶的比活力测定结果相似。酶的动力学参数结果表明,辛硫磷和甲氰菊酯对家蚕汰选后,酶活性的增加可能主要通过GST基因的转录调节的方式进行调控。以RT-PCR和定量PCR对GST基因转录水平检测,发现BmGSTe3和BmGSTe2分别在脂肪体和中肠中上调表达。因此,BmGSTe3和BmGSTe2的转录上调可能导致了GSTs酶活性的增加,这也可能是杀虫剂汰选后家蚕抗性增强的重要原因之一。5.BmGSTe3在Bac-to-Bac系统中的表达我们将可能参与杀虫剂抗性的重要基因BmGSTe3重组到Bacmid质粒上,获得重组质粒Bacmid-BmGSTe3,并进行真核表达。在脂质体Cellfectin的介导下,Bacmid-BmGSTe3转染Sf9细胞,分离获得病毒液。以杆状病毒液感染sf9细胞72h后,收集细胞培养液和细胞沉淀进行SDS-PAGE分析,均有目的条带（27.4 kD左右）,表明BmGSTe3在Sf9细胞中成功表达。以P4代重组病毒储液感染Sf9细胞,在感染后72h的培养液和细胞裂解液中都检测到了GSTs对CDNB活性,并且重组病毒转染后的比活力均显著高于野生型。活性测定结果进一步证实了BmGSTe3在sf9细胞中得到正确表达,而且BmGSTE3有较高的CDNB活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 谷胱甘肽-S-转移酶的分类、进化及其在基因组中的分布
• 1.1.1 谷胱甘肽-S-转移酶的分类与命名
• 1.1.2 谷胱甘肽-S-转移酶的进化
• 1.1.3 谷胱甘肽-S-转移酶在基因组中的分布
• 1.2 谷胱甘肽-S-转移酶结构与功能
• 1.2.1 谷胱甘肽-S-转移酶的结构
• 1.2.2 谷胱甘肽-S-转移酶的功能
• 1.3 昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的诱导
• 1.3.1 植物次生物质的诱导
• 1.3.2 杀虫剂和药物的诱导
• 1.4 谷胱甘肽-S-转移酶在昆虫抗药性形成中的作用与机制
• 1.4.1 昆虫抗药性的分子机制
• 1.4.2 谷胱甘肽-S-转移酶与有机磷抗性
• 1.4.3 谷胱甘肽-S-转移酶与有机氯抗性
• 1.4.4 谷胱甘肽-S-转移酶与拟除虫菊酯杀虫剂的抗性
• 1.5 谷胱甘肽-S-转移酶的表达调控机制
• 1.6 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶研究现状
• 第二章 引言
• 2.1 研究背景
• 2.2 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶研究的目的和重要意义
• 2.3 主要研究内容
• 2.4 实验技术路线
• 第三章 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶相关的生理学特性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 主要试剂、耗材与仪器
• 3.1.3 辛硫磷对家蚕的处理
• 3.1.4 生化样品制备与测定
• 3.1.5 数据分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶在组织与发育时期中的活性
• 3.2.2 家蚕各组织和发育时期中的谷胱甘肽含量
• 3.2.3 辛硫磷处理家蚕后谷胱甘肽-S-转移酶相关的生理学变化
• 3.2.4 不同蚕品系间谷胱甘肽-S-转移酶活性的比较
• 3.3 讨论
• 3.3.1 各组织中GSTs的活性
• 3.3.2 GSTs活性随发育时期的变化
• 3.3.3 有机磷诱导的氧化应激反应
• 3.3.4 家蚕中GSH含量的变化
• 3.4 结论
• 第四章 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶的生物信息学分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 分析数据及工具软件
• 4.1.2 分析方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 家蚕GST基因的鉴定、分类与进化
• 4.2.2 家蚕GST基因在基因组的分布
• 4.2.3 家蚕GST基因内含子的大小与分布
• 4.2.4 家蚕GST基因调控元件的预测
• 4.3 结论与讨论
• 第五章 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因的表达模式与克隆
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料与数据来源
• 5.1.2 主要试剂及配制
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.1.4 方法与步骤
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 基于ESTs数据的表达分析
• 5.2.2 基于芯片数据的GST基因发育时期的表达分析
• 5.2.3 GST基因在5龄第3天各组织中的表达
• 5.2.4 辛硫磷处理家蚕后GST基因的表达变化
• 5.2.5 GST基因的克隆
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 第六章 杀虫剂汰选后家蚕GSTs的表达变化
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 供试材料
• 6.1.2 主要试剂、耗材与仪器
• 6.1.3 杀虫剂汰选与毒力测定
• 6.1.4 GSTs酶活性测定
• 6.1.5 RNA提取与PCR的检测
• 6.1.6 数据分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 杀虫剂对家蚕的汰选
• 6.2.2 杀虫剂对家蚕汰选后GSTs酶活性的变化
• 6.2.3 杀虫剂对家蚕汰选后差异表达的GSTs基因
• 6.3 讨论
• 6.3.1 昆虫对有机磷和拟除虫菊酯抗性发展的比较
• 6.3.2 GSTs参与的杀虫剂抗性
• 6.3.3 昆虫GST基因的表达调控
• 6.4 结论
• 第七章 家蚕BmGSTe3基因的真核表达
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 载体和菌株
• 7.1.2 主要试剂与仪器
• 7.1.3 实验方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 BmGSTe3基因的克隆与序列分析
• 7.2.2 重组转座载体的构建和鉴定
• 7.2.3 重组杆状病毒质粒的获取与鉴定
• 7.2.4 重组杆状病毒质粒转染sf9细胞
• 7.2.5 SDS-PAGE分析
• 7.2.6 BmGSTe3重组融合蛋白的粗酶活性测定
• 7.3 结论与讨论
• 第八章 综合与结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表文章及参研课题
• 致谢