草鱼源ACE抑制肽的分离纯化及定量构效研究

论文摘要

本文建立了两种血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme,ACE）抑制肽体外活性检测方法即高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography,HPLC）和可见分光光度法（Visible spectrophotometricy,VSP）,对这两种方法进行比较。以草鱼肉为原料,通过碱性蛋白酶水解制备ACE抑制肽,采用超滤、大孔吸附树脂、制备型RP-HPLC分离纯化得到具有较高ACE抑制活性的纯度均一的草鱼肽组分,全自动蛋白质/多肽序列仪测定该组分的氨基酸序列,并用定量构效关系（quantitative structure activity relationship,QSAR）模型探讨了ACE抑制三肽的结构与活性之间的关系。HPLC法检测ACE抑制肽体外活性的色谱条件确定如下：色谱柱,ODS C18分析型色谱柱（5μm 4.6×150 mm）;二极管阵列检测器,检测波长,228 nm；流速,0.8 mL/min;流动相A,水（含0.05%TFA）；流动相B,乙腈（含0.05%TFA）；进样量,20μL；柱温,25℃；梯度洗脱条件：10％～60％B（10 min）:60％～10％B（2 min）;VSP法检测ACE抑制肽体外活性的显色条件确定如下：喹啉与苯磺酰氯的体积比2.5、显色反应温度30℃、反应时间30 min、无水乙醇添加量3.7 mL、避光放置时间30 min。对HPLC法和VSP法进行比较,发现HPLC法的检测限低于VSP法,而且HPLC法检测ACE抑制肽体外活性的线性、精确度、重复性及其产物的稳定性均比VSP法更高更好。分别用HPLC法和VSP法测定卡托普利、大豆肽和草鱼肽的ACE抑制活性和Ki值,VSP法测定的IC50值分别为O.00206±0.00005μg/mL.192±4.53μg/mL和153±4.29μg/mL,Ki值为7.09 nM,是HPLC法测定结果的1.07、1.07、1.18和1.44倍。采用碱性蛋白酶在pH9.0、温度50℃、酶与底物比48 AU/kg条件下水解草鱼蛋白,以水解度17.25%为水解终点制备草鱼肽,草鱼肽的IC50值为0.872±0.003 mg/mL,肽含量为65.48%。采用超滤、DA201-C大孔吸附树脂柱层析和制备型RP-HPLC对草鱼肽进行分离纯化,得到纯度均一的草鱼肽组分,其IC50值为0.00534±0.00003 mg/mL,运用全自动蛋白质／多肽序列仪测定该组分的氨基酸序列为VAP.VAP的消化稳定性试验表明：胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶不水解VAP.VAP的ACE水解稳定性试验表明：ACE也不水解VAP.VAP的抑制动力学试验表明：VAP是一种ACE抑制剂,其抑制类型为竞争性抑制,抑制剂常数Ki值为3.34 nM。收集已报道的76种不同来源的ACE抑制三肽,以其每个氨基酸侧链的疏水性质、立体性质或侧链体积大小和电荷性质参数以及三肽的疏水性质参数为自变量,三肽的Log（IC50）为因变量Y建立QSAR模型,模型方程为：Y=3.4639+0.0084X1-0.6281X2-0.0025X3+0.8119X4+0.5677X5-0.0107 X6+0.6139X7+0.5338X8-0.0228X9+1.0223X10N=76,R=0.7547,自变量X的解释能力为80.16%,因变量Y的解释能力为42.55%,模型的预测能力为60.30%。QSAR研究结果表明：C末端氨基酸的侧链体积对三肽ACE抑制活性的影响最大。N末端氨基酸的电荷指数小而疏水性大时,三肽ACE抑制活性强,同时该位的氨基酸侧链体积增大有利于提高三肽的ACE抑制活性,满足这些条件的氨基酸主要有Phe.Met.Ile.Leu等氨基酸；C末端和N端起第二位的氨基酸倾向于为侧链体积大而疏水性和电荷指数小的氨基酸,满足这些条件的氨基酸主要有Lys.Pro.Met等氨基酸。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 高血压及ACE的作用机制
• 1.2 ACE抑制剂
• 1.2.1 药用ACE抑制剂
• 1.2.2 食品源ACE抑制肽
• 1.3 ACE抑制肽活性检测方法
• 1.3.1 体外ACE抑制活性检测方法
• 1.3.2 体内ACE抑制活性检测方法
• 1.4 ACE抑制肽制备方法
• 1.4.1 酶解法
• 1.4.2 从发酵食品中分离提取法
• 1.4.3 从自溶产物中提取法
• 1.4.4 人工合成法
• 1.5 ACE抑制肽分离纯化方法
• 1.6 ACE抑制肽分析方法
• 1.6.1 ACE抑制肽结构的分析方法
• 1.6.2 ACE抑制肽结构与活性关系的分析方法
• 1.7 鱼降压肽的研究进展
• 1.8 课题研究背景及意义
• 1.9 课题研究内容
• 1.9.1 课题研究目的
• 1.9.2 课题研究内容
• 第2章 ACE抑制肽体外活性检测方法
• 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验设备
• 2.2 实验内容
• 2.2.1 HPLC法
• 2.2.2 VSP法
• 2.2.3 两种方法的比较
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 萃取前后反应液的比较
• 2.3.2 HPLC法
• 2.3.3 VSP法
• 2.3.4 方法的比较
• 2.4 本章小结
• 第3章 草鱼源ACE抑制肽的制备与分离纯化
• 前言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 实验内容
• 3.2.1 碱性蛋白酶水解鱼蛋白终点的选择
• 3.2.2 草鱼源ACE抑制肽的制备
• 3.2.3 草鱼源ACE抑制肽的分离纯化
• 3.2.4 分离组分纯度鉴定
• 3.2.5 蛋白质/多肽序列仪测定均一组分氨基酸序列
• 50值的测定'>3.2.6 草鱼肽IC₅₀值的测定
• 3.2.7 均一组分消化稳定性研究
• 3.2.8 均一组分ACE水解稳定性
• 3.2.9 均一组分抑制类型
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 酶解时间、水解度对ACE抑制活性的影响
• 3.3.2 超滤分离的各组分得率和ACE抑制活性
• 3.3.3 DA201-C大孔吸附树脂分离的各组分得率和ACE抑制活性
• 3.3.4 制备型RP-HPLC分离的各组分得率和ACE抑制活性
• 3.3.5 纯度鉴定
• 3.3.6 蛋白质/多肽序列仪测定组分6-1氨基酸序列
• 50值的测定'>3.3.7 草鱼肽IC₅₀值的测定
• 3.3.8 VAP的消化稳定性研究
• 3.3.9 VAP对ACE的稳定性
• 3.3.10 VAP抑制类型研究
• 3.4 本章小结
• 第4章 ACE抑制肽的定量构效关系研究
• 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 模型样本收集
• 4.1.2 模型构建
• 4.1.3 QSAR模型的检验
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 自变量共线性诊断
• 4.2.2 PLS建立模型及结果分析
• 4.2.3 QSAR模型的检验
• 4.3 本章小结
• 第5章 结论
• 5.1 结论
• 5.2 创新之处
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 组分6-1 氨基酸序列测定谱图
• 附录B 本文英语名词简写说明
• 攻读学位期间的研究成果