固定化细胞催化制备亚氨基二乙酸的研究

论文摘要

亚氨基二乙酸是合成农药除草剂草甘膦的重要中间体。而草甘膦是目前世界上应用最广、产量最大的农药,占全球总量的30%。且其销量逐年递增,需求旺盛。而亚氨基二乙酸路线生产草甘膦是世界主流的草甘膦生产方法。目前,亚氨基二乙酸的生产大多采用化学法,生产过程中会产生多种副产物和有毒有害物质,带来成本和环境方面的诸多问题。而酶法水解腈类化合物具有反应条件温和、环境污染小、成本低等优点,与化学法相比有明显的优势。目前已经有应用腈水解酶水解腈类化合物的成功例子,而对亚氨基二乙腈的酶法水解领域尚属空白。本文使用实验室保藏的一株氰降解菌Alcaligenes faecalis ZJB09133,以该菌体的固定化及反应器构建为主线,研究了固定化细胞催化水解亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的过程。以下为研究的主要内容。首先,建立底物和产物的分析方法。具体的分析方法为:色谱柱,HypersilSAX5μm4.6mm×200mm;流动相,20mM（NH4）2HPO4,用磷酸调pH为4;柱温为室温;检测波长,210 nm;流速,1.0 mL/min;进样量,20uL。其次,筛选合适的固定化载体,优化固定化细胞的制备过程和催化条件。同时考察固定化细胞的重复性和稳定性。具体的固定化方法为:海藻酸钠浓度2.0%,聚乙烯醇浓度8.0%,两种包埋材料混合加热溶解后,冷却至室温。加入8.0%（菌体与包埋剂的质量体积比m/v）菌体,混匀后通过蠕动泵滴加入4.0%氯化钙和饱和硼酸混合液中;成型12h。转化条件为:底物浓度1.0%,固定化细胞含菌体量0.2g,pH为8.0的Tris-HCl缓冲液,温度40℃、150rpm条件下转化。固定化细胞转化8h,产物得率为15%。固定化细胞重复使用10次,活力降为原来的30%,与游离细胞相比有明显的提高。同时固定化细胞和游离细胞的在一个月内活力都改变不大。最后,在制得固定化细胞的基础上构建固定化细胞生物反应器,并对其操作过程进行优化,初步研究其连续化生产亚氨基二乙酸的可行性。结果为,采用聚乙烯醇-海藻酸钠固定化细胞,在两个反应器串联的固定床反应器中连续催化水解0.8%的底物生产亚氨基二乙酸,在一周内固定化细胞活力稳定,产物得率为20%左右。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 亚氨基二乙酸的概况
• 1.2 亚氨基二乙酸的合成方法
• 1.2.1 亚氨基二乙酸的化学法合成
• 1.2.1.1 氯乙酸甘氨酸法
• 1.2.1.2 氨代氯乙酸法
• 1.2.1.3 氮川三乙酸法
• 1.2.1.4 二乙醇胺法
• 1.2.1.5 羟基乙腈法
• 1.2.1.6 氢氰酸法
• 1.2.1.7 亚氨基二乙腈水解生产亚氨基二乙酸新工艺
• 1.2.2 亚氨基二乙酸的生物法合成
• 1.2.3 亚氨基二乙酸的应用
• 1.2.3.1 农药
• 1.2.3.2 染料
• 1.2.3.3 水处理
• 1.2.3.4 精细化工中间体
• 1.2.3.5 其它
• 1.3 固定化细胞技术
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 细胞固定化方法
• 1.3.2.1 载体表面结合法
• 1.3.2.2 凝胶包埋法
• 1.3.2.3 细胞聚集法
• 1.3.2.4 物理截留法
• 1.3.2.5 细胞固定化新方法
• 1.3.3 固定化方法的选择
• 1.3.4 固定化细胞的应用
• 1.3.4.1 固定化细胞在食品工业中的应用
• 1.3.4.2 固定化细胞在发酵工业中的应用
• 1.3.4.3 固定化细胞在三废处理中的应用
• 1.3.5 细胞固定化技术的发展趋势
• 1.4 固定化细胞反应器
• 1.4.1 概述
• 1.4.2 固定化细胞常用的反应器
• 1.4.2.1 填充床反应器
• 1.4.2.2 流化床反应器
• 1.4.2.3 搅拌罐反应器
• 1.4.2.3 气升式反应器
• 1.4.2.5 膜反应器
• 1.4.3 固定化细胞反应器的发展方向
• 1.4.3.1 生物催化剂的改造
• 1.4.3.2 生物反应器的优化设计
• 1.5 本论文的研究意义
• 1.6 本课题的主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 检测方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 RP-HPLC检测方法
• 2.2.2.1.1 样品准备
• 2.2.2.1.2 色谱条件
• 2.2.2.2 HPLC检测方法
• 2.2.2.2.1 样品准备
• 2.2.2.2.2 色谱条件
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 检测方法的建立
• 2.3.1.1 流动相的选择
• 2.3.1.2 pH的选择
• 2.3.2 检测方法评价
• 2.3.2.1 标准曲线的制作
• 2.3.2.2 线性关系及检测限
• 2.3.2.3 稳定性和重现性实验
• 2.3.2.4 回收率实验
• 2.3.3 HPLC方法与RP-HPLC方法的比较
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 细胞固定化方法的选择及固定化条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂与材料
• 3.2.1.1 试剂
• 3.2.1.2 不同缓冲体系的配置（具体方法见附录1）
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 微生物培养
• 3.2.3.1 微生物菌种
• 3.2.3.2 微生物培养基
• 3.2.3.3 微生物培养条件
• 3.2.4 细胞的固定化方法
• 3.2.4.1 海藻酸钠包埋法
• 3.2.4.2 卡拉胶包埋法
• 3.2.4.3 琼脂凝胶包埋法
• 3.2.4.4 明胶包埋法
• 3.2.4.5 聚乙烯醇包埋法
• 3.2.4.6 壳聚糖包埋法
• 3.2.4.7 聚乙烯醇-海藻酸钠复合包埋法
• 3.2.4.8 壳聚糖-海藻酸钠
• 3.2.5 细胞转化方法
• 3.2.5.1 底物溶液的配置
• 3.2.5.2 游离细胞酶活力的测定
• 3.2.5.3 固定化细胞酶活力的测定
• 3.2.5.4 固定化细胞机械强度的测定
• 3.2.6 分析方法
• 3.2.6.1 IDA与IDAN的HPLC测定
• 3.6.2.2 产物得率的计算方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 固定化方法的选择
• 3.3.2 海藻酸钠固定化方法的条件优化
• 3.3.2.1 海藻酸钠浓度的选择
• 3.3.2.2 氯化钙浓度的选择
• 3.3.3 海藻酸钠固定化细胞的转化进程曲线
• 3.3.4 复合式包埋法的选择
• 3.3.5 聚乙烯醇-海藻酸钠固定化方法的条件优化
• 3.3.5.1 海藻酸钠浓度的选择
• 3.3.5.2 聚乙烯醇浓度的选择
• 3.3.5.3 氯化钙浓度的选择
• 3.3.5.4 包埋量的选择
• 3.3.6 固定化细胞转化条件的优化
• 3.3.6.1 底物浓度的选择
• 3.3.6.2 底物和产物对催化过程的抑制
• 3.3.6.3 转化pH的选择和固定化细胞的pH稳定性
• 3.3.6.4 转化温度的选择和固定化细胞的温度稳定性
• 3.3.7 PVA-SA固定化细胞的转化时间曲线
• 3.3.8 固定化细胞的转化批次和储存稳定性
• 3.3.8.1 固定化细胞的转化批次
• 3.3.8.2 固定化细胞的储存稳定性
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 固定化细胞反应器的初步研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂与材料
• 4.2.2 仪器设备
• 4.2.3 微生物培养
• 4.2.4 固定化方法
• 4.2.5 固定化细胞反应器的构建
• 4.2.5.1 流化床反应器
• 4.2.5.2 固定床反应器
• 4.2.6 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 流化床反应器
• 4.3.2 填充床反应器的操作条件优化
• 4.3.2.1 最佳转化温度的确定
• 4.3.2.2 最佳底物浓度的确定
• 4.3.2.3 最佳流速的确定
• 4.3.3 固定床反应器的操作稳定性
• 4.4 小结
• 参考文献
• 总结与展望
• 致谢
• 硕士在读期间已发表的论文
• 附录1 本论文所用到的缓冲液的配置