论文题目: 玉米淀粉分支酶基因表达调控的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 柴晓杰
导师: 王丕武
关键词: 淀粉分支酶基因,反义表达载体,启动子,转基因植株
文献来源: 吉林农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本项研究应用基因工程手段,克隆玉米淀粉分支酶基因的启动子和玉米淀粉分支酶基因,构建高效的反义表达载体和siRNA表达体系。通过农杆菌介导法和花粉管通道法将其导入玉米自交系,用以抑制淀粉分支酶基因的表达,调控淀粉的生物合成过程。以期通过基因工程手段,改变玉米淀粉合成途径,提高玉米直链淀粉的含量。取得如下结果: 1.以玉米品种“吉糯1号”的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到玉米淀粉分支酶基因的启动子序列,克隆到pMD18-T Vector上,测序结果表明,该启动子大小为934bp。采用DNASIS软件进行启动子序列结构分析,发现该启动子含有种子特异表达所必需的元件,如TATA-box、CAAT-box、TACACAT序列、CATGCA序列、胚乳基序、GCN4基序和ACGT元件。与已报道的序列比较仅有14个核苷酸发生改变,同源性为98.5%。用该启动子取代植物表达载体pBI121的35S启动子,与gus基因编码区连接,构建成融合质粒pSBE-gus。经农杆菌介导法转化烟草,获得了转基因植株。GUS活性检测结果表明,由该启动子序列引导的gus基因能在种子中表达,而在其它组织中表达微弱或未表达,证实该启动子具有种子特异性表达的功能。 2.以普通玉米自交系铁7922为材料,取授粉10d的幼胚盾片向上接种于MB培养基上,诱导出的胚性愈伤组织多为颜色鲜艳、质地紧密、呈浅黄色的Ⅱ型愈伤组织。愈伤组织诱导率为82.5%,胚性愈伤组织诱导率为39.16%。培养2周后将其转入调控培养基,2,4-D的浓度为2mg/L,愈伤组织转变率为45.716%;确定的农杆菌转化体系为浸染时间为25min,菌液浓度为OD600为0.6,共培养时间为3d,其转化率达3.3%。 3.应用PCR技术扩增了玉米淀粉分支酶的基因片段,将其克隆到pMD18-Tvector载体上,测序结果表明。克隆片段大小为1698bp。采用DNASIS软件进行序列分析,与已发表的基因一致。将玉米淀粉分支酶基因片段反向插入到pCAMBIA1301 35S启动子下,构建成表达质粒pCJS2b。通过农杆菌介导法将其导入玉米自交系,以再生植株叶片的总DNA为模板,35S启动子和终止子中的一对序列为引物进行PCR扩增,结果从转化植株中扩增到1800bp的特异带,而未转化的植株中未扩增到该特异带。为进一步确定外源基因的整合情况,对PCR阳性植株进行Southern blot分析。结果表明,转化株株均有杂交带出现,外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入。而未经转化的植株没有杂交信号出现。证明外源基因已整合到基因组中。对转基因植株T1代的PCR分析结果表明,外源基因在转基因后代中能够遗传,其分离比符合孟德尔的遗传规律。以转基因玉米籽粒的总RNA为模板,与DIG标记的探针进行Northern杂交,发现转基因植株内源SBE mRNA
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
第一篇 文献综述
1．淀粉分支酶的生物化学与分子生物学研究进展
1．1 淀粉分支酶的基础生物化学研究
1．2 淀粉分支酶基因的分子生物学研究
1．3 淀粉分支酶基因的应用前景
2．启动子的研究及应用
2．1 组成型启动子
2．2 组织特异型启动子
2．3 诱导型启动子
3．反义技术及其在植物基因工程中的应用
3．1 反义技术的作用机制
3．2 反义技术在植物改良上的应用
3．3 反义技术的研究展望
4．RNA干扰作用的研究进展
4．1 RNAi可能的分子机制
4．2 RNAi的分子生物学特性
4．3 RNAi的生物学意义
4．4 RNAi的应用及前景展望
5．玉米遗传转化的技术
5．1 农杆菌介导法
5．2 基因枪法
5．3 花粉管通道法
6．本项目研究的目的和意义
7．创新点
第二篇 研究内容
第一章 玉米淀粉分支酶基因启动子的克隆与功能分析
1．材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料
1．1．2 菌株和质粒
1．1．3 试剂与酶
1．1．4 培养基
1．1．5 人工寡核苷酸引物
1．2 方法
1．2．1 玉米总DNA的提取
1．2．2 玉米淀粉分支酶基因启动子的PCR扩增
1．2．3 PCR扩增产物电泳及DNA片段的回收
1．2．4 淀粉分支酶基因启动子的克隆和筛选
1．2．5 重组克隆的鉴定
1．2．6 淀粉分支酶基因启动子的序列分析
1．2．7 植物表达载体的构建
1．2．8 农杆菌介导转化烟草
1．2．8．1 农杆菌工程菌液的制备
1．2．8．2 外植体材料的培养和处理
1．2．8．3 烟草的转化与再生
1．2．8．4 烟草再生苗的分子检测
1．2．9 GUS活性的荧光检测和组织染色分析
1．2．9．1 GUS活性的荧光检测
1．2．9．2 GUS活性的组织染色分析
2．结果与分析
2．1 玉米淀粉分支酶基因启动子的分离和克隆
2．2 玉米淀粉分支酶基因启动子的序列分析
2．3 植物表达载体的构建
2．4 农杆菌介导转化烟草
2．4．1 烟草的浸染及共培养
2．4．2 选择培养和生根培养
2．5 转基因植株的鉴定
2．5．1 PCR检测
2．5．2 转基因植株的Southern杂交检测
2．6 GUS活性的检测
3．讨论
第二章 玉米淀粉分支酶基因的克隆和高效植物表达载体的构建
1．材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种与质粒
1．1．2 培养基
1．1．3 试剂与酶
1．1．4 人工寡核苷酸引物
1．2 方法
1．2．1 淀粉分支酶基因片段的PCR扩增
1．2．2 淀粉分支酶基因片段的克隆、筛选及鉴定
1．2．3 淀粉分支酶基因片段的序列分析
1．2．4 高效植物表达载体的构建
2．结果与分析
2．1 淀粉分支酶基因片段的PCR扩增
2．2 淀粉分支酶基因片段的克隆和序列测定
2．2．1 淀粉分支酶基因片段的克隆
2．2．2 淀粉分支酶基因片段的序列
2．3 玉米淀粉分支酶基因反义表达载体和siRNA表达体系的构建
2．3．1 玉米淀粉分支酶基因反义表达载体的构建
2．3．2 玉米淀粉分支酶基因siRNA表达体系的构建
3．讨论
第三章 玉米淀粉分支酶基因的遗传转化
1．材料与方法
1．1 材料
1．1．1 受体材料
1．1．2 菌种
1．1．3 培养基
1．2 方法
1．2．1 农杆菌介导的遗传转化
1．2．1．1 受体体系的建立
1．2．1．2 目的基因的转化及转化植株的筛选
1．2．2 花粉管通道法的遗传转化
2．结果与分析
2．1 受体体系的建立
2．2 农杆菌介导的遗传转化
2．3 抗性植株的分化和生根
2．4 转化植株的移栽
2．5 花粉管通道法的遗传转化
3．讨论
第四章 转基因植株的检测
1．材料与方法
1．1 材料
1．2 方法
1．2．1 PCR检测
1．2．2 转基因植株的Southern杂交
1．2．3 转基因植株的Northern杂交
1．2．4 转基因植株的淀粉分支酶活性的检测
1．2．5 转基因植株的直链及支链淀粉含量的测定
1．2．6 转基因植株后代的遗传分析
2．结果与分析
2．1 PCR检测
2．2 转基因植株的Southern杂交
2．3 转基因植株的Northern杂交
2．4 玉米淀粉分支酶活性的检测
2．5 直链淀粉含量的测定
2．6 转基因植株后代的遗传分析
3．讨论
结论
参考文献
附录1 英文缩略词表
附录2 常用缓冲溶液及培养基的配制
附录3 博士期间的主要研究成果
致谢
发布时间: 2006-01-04
参考文献
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- [2].转双反义SBE基因水稻的食用安全性及功效研究[D]. 李敏.中国疾病预防控制中心2009
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