β-TCP-DC、TGF-β、IGF-Ⅰ复合软骨细胞修复软骨缺损的实验研究

论文摘要

目的：关节软骨损伤后的修复一直是临床难题,这与软骨细胞再生能力差、局部修复因子浓度低及修复支架有关系。近年来软骨组织工程的发展,为这类损伤提供了一条可行的途径。本实验体外提取兔骨髓间充质干细胞,传代并诱导成软骨细胞,取异体兔耳软骨制成脱细胞软骨（decellularization cartilage, DC）,将其与纳米-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）复合,加入修复因子植入受损软骨模型,以观察其修复能力,为临床修复此类损伤提供实验依据。万法：体外提取新西兰大白兔骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stem cells BMSCs）在体外进行分离、培养、传代,测定其生长曲线,以流式细胞技术对其进行鉴定,传至第3代后加入诱导因子诱导成软骨细胞,行型胶原免疫组化Ⅱ染色进行鉴定。取异体兔耳软骨以胰蛋白酶—曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,行组织学染色及扫描电镜观察脱细胞情况及支架孔隙。在体外β-TCP-DC结合形成复合物,以负压吸引将诱导软骨细胞接种于此支架。孵育后将其植入已制备新西兰大白兔膝关节损伤模型,并将其分为空白、对照及实验三组。空白组缺损不加入修复材料,对照组植入β-TCP-DC修复,实验组植入β-TCP-DC同时定期注入转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-growth factor-Ⅰ、IGF-Ⅰ）,4个月后取修复模型行肉眼观察及组织学染色。结果：用密度梯度离心法可成功分离并扩增BMSCs,培养后细胞呈长梭形,旋涡状生长,传代细胞生长迅速、生长曲线良好,流式结果表明第3代高度表达CD29、CD44,而不表达CD45,表明所培养的BMSCs为单一细胞群,纯度较高。骨髓间充质干细胞诱导21d后Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色,可形成软骨细胞。兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度（33.70±4.33）μ m,孔隙率（65.23±7.35）%。体外将β-TCP-DC形成复合支架并接种诱导软骨细胞,组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。复合物植入缺损后第20周,空白组缺损未修复,底部为白色纤维组织。对照组缺损基本修复,但表面软骨形成差,表面不平整与周围正常软骨无良好连接。实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织,色泽与正常软骨相似,质韧,表面平整,与正常软骨界限消失,表面细胞平行于关节面,深层细胞排列紊乱,细胞呈团状,基质异染广泛,与周围正常软骨连接良好。结论：应用密度梯度离心法可成功分离并扩增BMSCs, BMSCs诱导为软骨细胞后与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性,p-TCP-DC复合支架有较多的孔隙结构,降解速度快,组织相容性及细胞粘附性好,TGF-β和IGF-Ⅰ具有促进软骨细胞增殖的作用,在新生软骨形成的同时,p-TCP-DC层状支架逐渐降解吸收,是组织工程修复关节软骨理想的种子细胞载体。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 实验一 BMSCs体外分离培养、诱导成软骨细胞、软骨脱细胞基质制备及软骨细胞与脱细胞支架复合的实验研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 实验二 纳米β-磷酸三钙-脱细胞软骨、转化生长因子-β及胰岛素样生长因子Ⅰ复合软骨细胞修复软骨缺损的实验研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果及发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表