论文摘要
目的:观察内皮抑素、多硫化肝素化内皮抑素及聚乙二醇化内皮抑素对脉络膜新生血管的抑制作用以及三者对血管生成相关因子VEGF及PEDF在脉络膜的表达情况的影响,进一步探讨内皮抑素及其修饰物抑制新生血管的作用机制,并比较三种药物对脉络膜新生血管抑制作用的差异,为找到一种合适的内皮抑素修饰物提供思路。方法:采用80只SPF级雌性健康成年C57BL/6小鼠(体重均在20g以上),随机分为8组,每组10只,PBS对照3天组和7天组、内皮抑素3天组和7天组、多硫化肝素化内皮抑素3天组和7天组、聚乙二醇化内皮抑素3天组和7天组,,采用532nm半导体激光诱导脉络膜新生血管动物模型后,玻璃体腔分别注射10μg/μl内皮抑素、多硫化肝素化内皮抑素、聚乙二醇化内皮抑素及磷酸盐缓冲液(PBS)各1μl。HE染色和脉络膜铺片法观察新生血管的形态,大小并检测各组小鼠脉络膜新生血管的面积,进行统计学分析。提取各组小鼠脉络膜组织总RNA,采用实时荧光定量PCR检测脉络膜新生血管相关因子:VEGF、PEDF的表达情况。蛋白质印迹法(western bloting)分析VEGF蛋白及PEDF蛋白的表达情况。结果:1.HE染色和脉络膜铺片法无论是3天组还是7天组,PBS对照组与其他三个治疗组相比:脉络膜新生血管的面积明显大于其他三组,差异有统计学意义(P＜0.05);内皮抑素组脉络膜新生血管的面积大于多硫化肝素组和聚乙二醇化内皮抑素组,差异均有统计学意义(P＜0.05),多硫化肝素组与聚乙二醇化内皮抑素组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。2.western bloting试验western bloting结果证实脉络膜组织中有VEGF蛋白和PEDF蛋白的表达。3天组和7天组分析结果均显示VEGF蛋白在各组脉络膜组织中的表达强弱顺序为:对照组＞内皮抑素组＞多硫化肝素化内皮抑素组＞聚乙二醇化内皮抑素组,多硫化肝素化内皮抑素组与聚乙二醇化内皮抑素组之间差异无统计学意义(P＞0.05),其它任意两组之间差异均有统计学意义(P＜0.05);PEDF蛋白的表达强弱顺序为:对照组＜内皮抑素组＜多硫化肝素组＜聚乙二醇化内皮抑素组,多硫化肝素化内皮抑素组与聚乙二醇化内皮抑素组之间差异无统计学意义(P＞0.05),其它任意两组之间差异均有统计学意义(P＜0.05)。3.实时荧光定量PCR试验实时荧光定量PCR检测结果证实脉络膜组织中有VEGFmRNA及PEDFmRNA的表达,产物大小与预期产物大小一致。3天组和7天组分析结果均显示VEGFmRNA表达的强弱顺序为:对照组＞内皮抑素组＞多硫化肝素化内皮抑素组＞聚乙二醇化内皮抑素组,四组之间差异均有统计学意义(P＜0.05);PEDFmRNA表达的强弱顺序为:对照组＜内皮抑素组＜多硫化肝素组＜聚乙二醇化内皮抑素组,四组之间差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论:1.从mRNA水平及蛋白水平证明内皮抑素、多硫化肝素化内皮抑素、聚乙二醇化内皮抑素均能有效抑制脉络膜新生血管的生成。2.内皮抑素、多硫化肝素化内皮抑素、聚乙二醇化内皮抑素均能有效调节新生血管相关因子VEGF及PEDF的表达,可使促血管生成因子VEGF的表达减弱,血管生成抑制因子PEDF的表达增强,两种修饰物的作用明显优于内皮抑素本身。3.聚乙二醇化内皮抑素可能是一种较好的内皮抑素修饰物,其作用优于多硫化肝素化内皮抑素,从而为脉络膜新生血管性疾病的治疗提供了新的途径。