莱克多巴胺及磺胺二甲基嘧啶免疫学快速检测技术研究

论文摘要

莱克多巴胺属于β-受体激动剂家族苯乙胺类成员之一,此类化合物因其具有促进和提高动物生长效率而受关注,莱克多巴胺在增加猪日增重、提高胴体瘦肉率、增加饲料转化、降低脂肪的积聚、缩短饲养周期等方面具有强大的功效。莱克多巴胺常被猪场作为饲料添加剂使用,莱克多巴胺的非法使用,导致了其在动物体内的蓄积性残留,引发人体的急性食物中毒。因此,我国及欧盟各国政府禁止进口含有Rac的肉品,并明确规定禁止使用Rac作为促生长剂。为了控制和预防猪的某些疾病、促进猪的生长,磺胺二甲基嘧啶常常被添加在猪的饲料之中,磺胺二甲基嘧啶在饲喂动物的组织中具有蓄积作用,猪组织中磺胺二甲基嘧啶的残留,对消费者而言将是一种潜在的危害,可引起过敏反应、干扰肠道菌群并诱生抗性菌群,从而导致抗生素的疗效下降。磺胺二甲基嘧啶还是一种可疑的致癌物,研究表明高浓度的磺胺二甲基嘧啶可以引起鼠的甲状腺瘤。FDA规定了磺胺二甲基嘧啶的休药期为15d,并设定了磺胺二甲基嘧啶在组织中的最高残留限量为100ng/g。近年来,磺胺二甲基嘧啶及莱克多巴胺残留已成为人们共同关注的重大问题。以GC、MS、LC技术为基础建立了检测Rac、SM2的确证方法,这些方法具有高度的敏感性,但所需仪器设备昂贵、前处理繁琐、检测费时,要完成大量样品的检测存在较大的困难,因此,目前急需简单快速、经济实惠、能够用于大批样品的检测方法。本研究旨在研发敏感特异、简单快速、能用于日常监督和检测的可靠筛选方法。在该研究中重点集中于BSA-SM2、BSA-Rac的免疫原性的研究,建立了能够高效分泌SM2、Rac单抗的杂交瘤细胞9株,并制备生产了上述单抗。设计研发了SM2、Rac残留检测试剂盒4种、快速检测试纸条2种,产品性能通过了HPLC、GC-MS的确证。主要研究内容如下:在分析Rac分子结构和免疫原性的基础上,利用化学修饰法将活性基团羧基引入Rac苯环上,应用混合酸酐法使引入的活性基团羧基与牛血清白蛋白（BSA）分子上的氨基发生反应形成酰胺键,制备BSA-Rac结合抗原,用同样的方法制备OVA-Rac。用重氮化法将SM2偶联于BSA和鸡卵清蛋白OVA,合成人工免疫原BSA-SM2和包被抗原OVA-SM2,通过红外（IR）、紫外（UV）、SDS-PAGE分析,证明药物与蛋白成功偶联,BSA-SM2、BSA-Rac分子结合比分别约为1:19和1:20;小鼠免疫实验证明,上述人工抗原能够诱导针对药物的特异性抗体。用BSA-SM2、BSA-Rac免疫Balb/c鼠5次,SM2、Rac抗体效价均达到了6.4×103,SM2半数抑制浓度（IC50）为9.51 ng/mL,Rac的IC50为7.11 ng/mL,经琼脂扩散、阻断ELISA、胶体金印迹实验鉴定,除磺胺甲基嘧啶与SM2抗体轻微交叉外,其它化合物与SM2抗体和Rac抗体均无交叉反应。以聚乙二醇（PEG1500）为融合剂,将免疫鼠脾细胞与NS0瘤细胞融合建立了杂交瘤细胞系,获得了稳定分泌抗SM2和Rac高亲和力、高敏感性抗体的杂交瘤细胞9株。SM2杂交瘤细胞株分别为SM2H10,SM2E2,SM2A10和SM2G5,细胞上清效价为3.2×102-6.4×102,腹水效价为6.4×104-3.2×105,单抗亚型为IgG2a/κ,IgG1/λ,IgG1/κ,亲和常数（Ka）为3.71×108-2.21×109L/mol。Rac杂交瘤细胞株分别为RacB5,RacC3,RacE6,RacH1和RacF4,细胞上清效价为3.2×102-6.4×102,腹水效价为1.28×105-6.4×105,单抗亚型为IgG2a/κ,IgG2b/λ,IgG1/κ,IgG2a/λ,亲和常数（Ka）为5.46×108-3.43×109L/mol。研制出了SM2、Rac快速检测试剂盒A（SM2-Kit A,Rac-Kit A）和试剂盒B（SM2-Kit B,Rac-Kit B）,试剂盒A的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,线性检测范围为1.0-128.0 ng/mL,检测限为1.0 ng/mL。SM2-KitA和Rac-Kit A饲料的平均添加回收率分别为89.4%、89.1%、猪尿的平均添加回收率分别为90.5%、91.8%;平均批内和批间变异系数均小于15%;SM2-KitA与磺胺甲基嘧啶的交叉反应率为2.75%,Rac-Kit A与其他化合物无交叉反。不同稀释基质对SM2-KitA和Rac-Kit A的检测结果没有影响;试剂盒在4℃保存,有效期为6个月。试剂盒B稍逊于试剂盒A,实验结果证明两者均可用于SM2、Rac残留的快速检测。利用胶体金标记技术,成功研制了SM2、Rac残留快速检测试纸,两种试纸的标准检测曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合。Rac-Strip、SM2-Strip机读检测限分别为0.154 ng/mL和0.165 ng/mL,目测检测限分别为2.0 ng/mL和3.0 ng/mL,SM2-Strip与磺胺甲基嘧啶有轻微交叉反应,Rac-Strip无交叉反应,检测试纸在4℃保存,有效期为12个月。HPLC确证实验表明,SM2-strip和HPLC之间的差异为1.3%-4.3%,SM2-kit和HPLC之间的差异为2.5%-4.6%;数据统计分析证明SM2-strip及SM2-kit和HPLC检测结果无显著差异。GC-MS确证实验表明,Rac-strip和GC-MS的差异为1.0%-4.7%,Rac-kit和GC-MS的差异为1.1%-4.0%,数据统计分析证明Rac-strip、Rac-kit和GC-MS检测结果无显著差异。SM2和Rac试剂盒和试纸条,具有特异敏感、简单快速、易于操作、经济实惠的特点,试剂盒检测需时40min,试纸条检测需时10min,结果可靠,可用于定性和半定量检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 磺胺类药物残留检测研究进展
• 1.1 磺胺类药物的特性
• 1.1.1 磺胺类药物的理化性质
• 1.1.2 磺胺类药物的分类
• 1.1.3 磺胺类药物的药理作用机理
• 1.1.4 磺胺类药物的化学结构与生物活性的关系
• 1.1.5 磺胺类药物的体内代谢特点
• 1.2 磺胺类药物的应用及安全评价
• 1.2.1 磺胺类药物的应用
• 1.2.2 磺胺类药物对机体的危害
• 1.2.3 磺胺类药物对环境的危害
• 1.3 磺胺类药物的残留检测及监控
• 1.3.1 微生物学检测法
• 1.3.2 理化检测方法
• 1.3.3 免疫学检测方法
• 1.3.4 兽药残留的监控
• 第二章 莱克多巴胺残留检测研究进展
• 2.1 莱克多巴胺的特性
• 2.1.1 莱克多巴胺的理化性质
• 2.1.2 莱克多巴胺对动物生长性能的影响
• 2.1.3 莱克多巴胺的构效关系
• 2.1.4 莱克多巴胺的作用机理
• 2.1.5 莱克多巴胺对机体组织的影响
• 2.1.6 莱克多巴胺体内代谢过程
• 2.2 莱克多巴胺的残留、使用及安全评价
• 2.2.1 莱克多巴胺的代谢残留
• 2.2.2 莱克多巴胺的使用
• 2.2.3 莱克多巴胺对动物和人的毒性作用
• 2.3 莱克多巴胺的残留检测
• 2.3.1 酶联免疫检测方法
• 2.3.2 高效液相色谱法
• 2.3.3 气质联用及液-质联用法
• 2.3.4 免疫传感器法
• 2.3.5 免疫金标试纸法
• 第三章 本论文研究目的和意义
• 第四章 SM2和Rac人工抗原的制备及特性鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 SM2和Rac人工抗原的鉴定
• 4.2.2 SM2和Rac人工抗原免疫原性的鉴定
• 4.3 讨论与小结
• 4.3.1 关于人工完全抗原的设计
• 4.3.2 关于人工完全抗原的制备方法
• 4.3.3 关于人工抗原的免疫原性
• 4.3.4 小结
• 第五章 SM2、Rac单克隆抗体的制备及其特性鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 细胞融合小鼠的选择
• 5.2.2 杂交瘤细胞株的建立
• 5.3 讨论与小结
• 5.3.1 关于小鼠免疫和血清抗体
• 5.3.2 关于融合小鼠的选择方法及注意事项
• 5.3.3 关于杂交瘤细胞株的筛选方法
• 5.3.4 关于mAbs亲和力常数的测定方法
• 5.3.5 关于抗体胶金印迹试验
• 5.3.6 小结
• 第六章 试剂盒的研制及SM2和Rac在猪尿中的排泄规律
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 ELISA试剂盒A
• 6.2.2 ELISA试剂盒B
• 6.2.3 试剂盒A与试剂盒B性能的比较
• 6.2.4 试剂盒测定SM2和Rac在猪尿液中的排泄规律
• 6.3 讨论与小结
• 6.3.1 小分子半抗原的免疫学分析
• 6.3.2 小分子半抗原检测方法及原理
• 6.3.3 指示系统的标记酶
• 6.3.4 酶标记方法
• 6.3.5 试剂盒A和试剂盒B的特点
• 6.3.6 SM2和Rac的休药期
• 6.3.7 小结
• 第七章 SM2和Rac快速检测试纸的研制及对样品的测定
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 胶体金颗粒大小及均一性鉴定
• 7.2.2 mAbs最佳标记浓度的测定
• 7.2.3 检测试纸的组装
• 7.2.4 试纸机读检测方法的建立
• 7.2.5 半定量目测检测方法及检测极限
• 7.2.6 检测试纸的特异性
• 7.2.7 检测试纸的重复性
• 7.2.8 保存期检验
• 7.2.9 试纸对样品的检测
• 7.3 讨论与小结
• 7.3.1 试纸的检测原理
• 7.3.2 胶体金颗粒大小与标记的关系
• 7.3.3 胶体金标记技术的优势
• 7.3.4 胶体金的制备方法
• 7.3.5 胶体金的质量鉴定
• 7.3.6 最佳标记蛋白浓度的测定
• 7.3.7 NC膜的性能与检测结果
• 7.3.8 检测试纸的特性
• 7.3.9 小结
• 第八章 快速检测试纸和试剂盒与确证方法的比较
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 方法
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 试剂盒和试纸条与确证方法参数的比较
• 8.2.2 SM2试剂盒和试纸条与确证方法的比较
• 8.2.3 Rac试剂盒和试纸条与确证方法的比较
• 8.2.4 GC-MS与SM2试剂盒和试纸条对猪尿液测定结果的比较
• 8.2.5 GC-MS与Rac试剂盒和试纸条对猪尿液测定结果的比较
• 8.3 讨论与小结
• 8.3.1 SM2和Rac残留检测方法的要求
• 8.3.2 SM2和Rac不同检测方法敏感性的比较
• 8.3.3 SM2和Rac不同检测方法所需费用和时间的比较
• 8.3.4 小结
• 研究结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录