黑龙江部分地区野生鸟类AIV和NDV感染状况的初步研究

论文摘要

禽流感和新城疫是危害禽养殖业的两种主要疾病，近年来，新城疫的爆发出现新的特点，免疫失败的报道增多；禽流感不仅严重危害禽养殖业，给世界经济带来严重影响，而且危及人类生命，引起了世界各国的高度重视。野生鸟类是禽流感和新城疫的重要宿主，研究野生鸟类中这两种疾病流行情况，对于了解野生鸟类在禽流感和新城疫传播过程中的作用以及防控这两种疾病的爆发都有着重要的意义。2005年至2006年在黑龙江省部分地区采集了183只野生鸟类个体肛、咽拭子的样品，对这些样品利用无特定病原体（SPF）鸡胚传代的方法进行了对AIV及NDV的分离，并利用RT-PCR和血凝试验的方法进行检测和初步鉴定。结果表明，所采集的样品中，共分离出AIV21株，分离率为11.5％，NDV检测呈阳性的样品16株，感染率为8.7％。然后，我们参考GenBank中AIV的8个片段的相应的核甘酸序列，设计并合成了12对特异性引物，用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，扩增其中一株野鸭源AIV（A／Mallard／SanJiang／151／06（H6N2））基因组的8个基因片段，其中HA、PA、PB1、PB2这4个基因分为两段扩增。PCR产物经纯化、连接测序载体、转化感受态细胞以及重组质粒阳性鉴定后，进行序列测定。测序完成后，用生物学软件对其核甘酸序列以及推导的氨基酸序列进行分析，并将这些序列与国内外H6N2亚型的部分分离株的相应核甘酸序列以及其推导的氨基酸序列进行同源性比较和遗传进化分析。测序结果表明，所得到的AIV的8个片段均含有完整的开放阅读框架以及5′端和3′端的非编码区序列。通过NCBI的BLAST比较，该分离株起源于欧亚群系，与北海道地区流感分离株遗传关系密切，有着相似的遗传演化过程。对该病毒HA基因进行氨基酸序列分析，在其裂解位点的氨基酸序列为340PQIETR↓G346，与低致病性禽流感的HA的裂解位点相一致，且H6N2亚型到目前为止还没有高致病力毒株的报道，可以推断该分离株A／Mallard／SanJiang／151／06（H6N2）为非高致病力毒株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 禽流感病毒的研究进展
• 1.2.1 AIV的发现及其发展历史
• 1.2.2 AIV的分类地位、形态及其命名
• 1.2.3 AIV的化学组成及对理化因素的抵抗力
• 1.2.4 AIV的增殖及其实验室宿主
• 1.2.5 AIV的流行病学研究
• 1.2.6 AIV的病毒的基因组及其编码的蛋白
• 1.2.7 AIV抗原的变异
• 1.3 新城疫病毒的研究进展
• 1.3.1 新城疫的发现及其流行趋势
• 1.3.2 NDV的分类地位、形态及其命名
• 1.3.3 NDV的化学组成及对理化因素的抵抗力
• 1.3.4 NDV的实验室宿主系统
• 1.3.5 NDV的流行病学研究
• 1.3.6 NDV的基因组及其结构蛋白
• 1.3.7 NDV的变异
• 1.4 本课题研究的目的和意义
• 2 实验1 黑龙江部分地区野禽AIV和NDV感染情况的初步研究
• 2.1 实验材料和实验仪器
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 鸡胚及红细胞
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品的采集和病毒的分离
• 2.2.2 红细胞凝集实验（HA）
• 2.2.3 AIV及NDV的RT-PCR检测
• 2.2.4 PCR结果鉴定
• 2.2.5 AIV血凝素亚型及神经氨酸酶亚型的鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 黑龙江省部分地区野生鸟类感染AIV和NDV的情况
• 2.4.2 野生鸟类在传播AIV及NDV中的作用
• 2.4.3 野生鸟类中AIV的生态流行病学及其意义
• 2.4.4 不同种属的野生鸟类对于AIV、NDV的易感程度
• 2.4.5 我国特有的养殖模式对于野生鸟类传播AIV的影响
• 2.4.6 AIV各分离株概况
• 3 实验2 禽流感分离株A/Mallard/SanJiang/151/06（H6N2）全基因克隆及序列分析
• 3.1 实验材料及实验试剂
• 3.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 实验引物
• 3.3.2 病毒RNA的提取
• 3.3.3 cDNA的合成
• 3.3.4 PCR扩增
• 3.3.5 PCR产物的克隆
• 3.3.6 PCR方法鉴定重组质粒
• 3.3.7 序列测定
• 3.3.8 序列比较分析
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 RT-PCR电泳结果
• 3.4.2 PCR鉴定阳性质粒结果
• 3.4.3 A/Mallard/Sanjiang/151/2006（H6N2）全基因组测序结果
• 3.4.4 分离株与H6N2亚型AIV全基因序列同源性比较
• 3.4.5 分离株各基因片段Blast分析结果
• 3.4.6 遗传进化关系比较
• 3.5 讨论
• 3.5.1 分离株HA基因特性及其遗传进化关系
• 3.5.2 分离株NA基因特性及其进化关系
• 3.5.3 分离株NS基因的特性及其进化关系
• 3.5.4 分离株聚合酶基因遗传进化关系分析
• 3.5.5 分离株NP和M基因的遗传进化关系分析
• 3.5.6 关于分离株基因组各基因来源的推测
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢