鸭瘟病毒gI基因的原核表达、多抗制备、转录时相及感染细胞定位研究

论文摘要

论文对本实验室鉴定的鸭瘟病毒（duck plague virus, DPV） gI基因（GenBank登录号EU035298）开展了以下系列研究：DPV gI基因分子特征分析、克隆、原核表达和抗体制备、DPV体外感染宿主细胞后gI基因的转录时相分析及gI蛋白在细胞中的定位分析,结果如下：1. DPV gI基因的分子特性预测DPV gI基因开放性阅读框（ORF）长度为1116bp,编码371aa的蛋白多肽。多序列比对发现与疱疹病毒gI基因家族具有较高的相似性,进化树分析表明gI蛋白与马立克病毒属中的MeHV-1、GaHV-2和GaHV-3等禽类疱疹病毒同源蛋白的进化关系最近,但其本身是一个独立的进化支。该蛋白具有一些囊膜糖蛋白的典型特征,包括具有N-端信号肽,3个潜在的N-连接糖基化位点以及C-端跨膜区。另外分析表明DPV gI蛋白有19个潜在的磷酸化位点,13个抗原位点,亚细胞定位分析表明蛋白主要定位于胞质网状结构中（55.6%）。密码子偏爱性分析表明DPV gI基因中同义密码子第三位A、T碱基的使用频率更高,且密码子偏性较低,推测为低表达基因。与大肠杆菌、酵母和人比较,使用偏爱性差异较大的密码子数分别为26个、24个和31个,因此,DPV gI的密码子偏爱性与原核生物和真核生物均较为接近,其基因表达可选择大肠杆菌或酵母表达系统。2. DPV gI基因原核表达及其多克隆抗体制备PCR扩增出一条长为1221bp的核酸片段,该片段涵盖了完整的gI基因,将该片段插入T-克隆载体pMD18-T,构建重组质粒PMD18-T-gI通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切消化pMD18-T-gI质粒提取插入片段,再将该片段定向插入原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒PET-32a（+）-gI。经PCR、双酶切及测序鉴定后将重组质粒PET-32a（+）-gI转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行表达。DPVgI基因在IPTG的诱导下成功表达。SDS-PAGE分析表明含有6xHis标签的g1蛋白分子量约为61 kDa。蛋白最佳表达条件为加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG,37℃下诱导表达6 h,可溶性分析表明目的蛋白主要以细胞沉淀（包涵体）形式表达。用镍柱亲和层析方法对带6xHis标签的重组蛋白进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白6×His-gI。重组蛋白经Western-blot检测显示能被兔抗DPV阳性血清识别。利用纯化蛋白对家兔进行免疫,制备兔高免血清。琼脂扩散实验检测血清效价达1：32。该血清经Western-blot检测显示能识别表达的重组蛋白,具有较好特异性。3.DPV感染DEF后gI基因的转录分析通过荧光定量PCR方法对DPV gI基因在鸭胚成纤维细胞的转录分析表明,在感染早期DPV gI基因的转录水平较低,12h前呈缓慢增长状态,12h后急剧上升至48h时达到高峰,然后有所下降。DPV gI基因在感染晚期大量转录的现象提示基因编码产物可能参与成熟病毒粒子的囊膜化装配。除此之外,还采用核酸蛋白合成抑制方式研究gI基因的转录情况,即在核酸抑制剂阿昔洛韦（ACV）和蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）作用下gI基因的转录情况。结果显示gI基因的转录受到ACV和CHX的抑制,说明该基因的转录依赖宿主蛋白的表达,且在DNA复制完成以后。因此,综上转录模式的分析可推断DPVgI基因为疱疹病毒晚期基因。4. DPVgI基因产物在DEF中的表达与定位以兔抗DPV gI重组蛋白血清为一抗,采用免疫荧光技术进行DPV感染鸭胚成纤维细胞后gI蛋白的定位检测。结果表明最早可在感染4h的细胞质中观测到微弱的特异荧光,随着感染时间延长,感染12h和24h均可观测到强烈的特异荧光,荧光在靠近胞核的细胞质中呈局域性集中分布,该分布模式提示gI蛋白可能大量积聚于诸如高尔基体类的细胞器中。在感染晚期,随着一系列形态学病变,细胞质大量裂解,细胞核破碎,特异荧光逐渐衰减。因此,从gI蛋白的分布特征可以推测该蛋白主要在细胞质中合成。

论文目录

• 本论文的创新性工作
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述及选题目的和意义
• 第一章 疱疹病毒gI基因及其编码蛋白的研究进展
• 1. 疱疹病毒gI基因及其编码蛋白的研究进展
• 1.1 疱疹病毒概述
• 1.2 疱疹病毒gI基因的特点
• 1.3 疱疹病毒gI基因编码蛋白的特点
• 1.4 疱疹病毒gI蛋白的亚细胞定位
• 1.5 疱疹病毒gI蛋白的功能
• 1.6 疱疹病毒gI蛋白与其他蛋白的相互作用
• 1.7 展望
• 2. 选题的目的和意义
• 第二部分 实验研究
• 第二章 鸭瘟病毒gI基因生物信息学分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 鸭瘟病毒gI基因核酸特征分析
• 2.2 鸭瘟病毒gI基因编码蛋白特征分析
• 2.3 鸭瘟病毒gI基因密码子偏爱性分析
• 3. 讨论
• 3.1 关于生物信息学
• 3.2 鸭瘟病毒gI基因及其编码蛋白特征分析
• 3.3 鸭瘟病毒gI基因密码子偏爱性对表达的影响
• 第三章 鸭瘟病毒gI基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备
• 1. 材料
• 1.1 毒株、菌株及载体
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要溶液及配制
• 1.5 主要仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 DPV基因组DNA的提取
• 2.2 PCR扩增
• 2.3 T-克隆与鉴定
• 2.4 DPVgI基因表达载体的构建
• 2.5 DPVgI重组蛋白的表达及条件优化
• 2.6 DPVgI重组蛋白的纯化
• 2.7 Western-blot鉴定DPVgI重组蛋白
• 2.8 兔抗DPV 6×His-gI多克隆抗体的制备
• 2.9 琼脂扩散试验检测兔抗6×His-gI抗体效价
• 2.10 兔抗DPV gI重组蛋白IgG的纯化及鉴定
• 3. 结果
• 3.1 DPVgI基因的扩增和T-克隆鉴定
• 3.2 重组表达质粒pET-32a（+）-gI的鉴定
• 3.3 DPVgI重组蛋白的表达及条件优化
• 3.4 兔抗DPV 6×His-gI重组蛋白的Western-blot鉴定
• 3.5 兔抗DPV6×His-gI重组蛋白血清效价的琼脂扩散试验检测
• 3.6 Western-blot检测兔抗DPV 6×His-gI重组蛋白血清特异性
• 3.7 兔抗DPV 6×His-gI重组蛋白IgG的纯化及鉴定
• 4. 讨论
• 4.1 外源基因的融合表达
• 4.2 多克隆抗体的制备及纯化
• 第四章 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞gI基因转录时相分析
• 1. 材料
• 1.1 毒株/细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 其他
• 2. 方法
• 2.1 FQ-PCR检测DPV感染宿主细胞后gI基因的转录
• 2.2 核酸蛋白合成抑制试验分析gI基因类型
• 3. 结果
• 3.1 RNA质量检测
• 3.2 引物特异性检测
• 3.3 FQ-PCR标准曲线的绘制
• 3.4 DPV体外感染DEF后gI基因转录情况
• 3.5 核酸蛋白合成抑制后体外感染DEF的DPV gI基因转录情况
• 4. 讨论
• 4.1 荧光定量PCR法检测DPV gI基因转录情况
• 4.2 核酸蛋白合成抑制试验分析gI基因类型
• 第五章 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞gI基因的表达与定位
• 1. 材料
• 1.1 毒株/细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 间接免疫荧光检测DPV gI蛋白在细胞中定位方法的建立
• 2.2 间接免疫荧光检测DPV gI蛋白在细胞中定位方法的优化
• 2.3 结果判定标准
• 2.4 DPV gI蛋白细胞定位的动态监测
• 3. 结果
• 3.1 间接免疫荧光检测DPV gI蛋白细胞定位方法的建立及优化
• 3.2 DPV gI蛋白细胞定位的动态监测
• 4. 讨论
• 第三部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文