鲤胰岛素样生长因子的克隆与表达研究

论文摘要

胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors，IGFs），包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，是一类具有胰岛素样代谢和促有丝分裂功能的单链多肽。可促进细胞的增殖、分化、迁移、生长和代谢。研究表明，IGFs在鱼类生长、繁殖、发育、渗透压调节及免疫等方面具有重要的作用。但由于血清中IGFs含量较低且与IGF结合蛋白结合存在，因此提取有活性的天然IGFs蛋白较困难。为了获得足量的、具有生物学活性的重组鱼类IGFs蛋白，以利于鱼类IGF系统的基础和应用研究的不断深入，本研究在克隆鲤IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的基础上，运用大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统对鲤IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的基因工程表达进行了研究。1．运用RT-PCR技术，从鲤肝脏总RNA中扩增出IGF-Ⅰ成熟肽cDNA序列，IGF-Ⅱ前肽cDNA序列，连接至pMD18-T载体，测序结果表明，与已报道的序列相比，克隆的鲤IGF-Ⅰ与其完全相同，IGF-Ⅱ基因有1个位点发生同义突变。2．构建原核表达载体pGEX-KG-IGF-Ⅰm和pET-32a-IGF-Ⅱm，重组质粒转化大肠杆菌BL21并进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析，重组菌可表达分子量分别约为34kDa和28kDa的重组蛋白，且目的蛋白主要以包涵体的形式存在，经0.3 mmol／LIPTG诱导3h后，表达量均出现最高，占菌体总量的300％～35％。提取包涵体，并进行SKL变性及透析复性处理，由此初步纯化了原核重组蛋白IGFs。3．以初步纯化的原核重组蛋白IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ为抗原，分别免疫新西兰大耳兔，制备了兔抗鲤IGF-Ⅰ／IGF-Ⅱ抗血清。抗血清经间接ELISA检测效价分别为3200和6400，Western-blot显示抗血清均能与重组蛋白发生特异性反应。4．构建酵母表达载体pPIC9K-IGF-Ⅰm，LiCl法转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型分析、G418筛选及PCR鉴定，得到His+Mut+型抗2.0 mg／mL G418的多拷贝转化子。以0.5％甲醇诱导培养，Dot-Blot及Tricine-SDS-PAGE电泳显示培养上清含大小约7.5kDa的重组IGF-Ⅰ蛋白，在诱导3d后，表达量最高。Western-blot分析表明，此真核表达蛋白能与兔抗IGF-Ⅰ多克隆抗体发生特异性免疫反应。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 胰岛素样生长因子研究进展
• 1.1.1 胰岛素样生长因子及其系统简介
• 1.1.2 胰岛素样生长因子的分子结构
• 1.1.3 胰岛素样生长因子结合蛋白
• 1.1.4 胰岛素样生长因子受体
• 1.1.5 胰岛素样生长因子的表达调节
• 1.1.6 胰岛素样生长因子生理作用
• 1.2 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 载体和菌株
• 2.1.3 主要试剂及药品
• 2.1.4 主要溶液及缓冲液
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.1.7 PCR引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 IGFs PCR扩增
• 2.2.2 载体的构建
• 2.2.3 鲤IGFs在大肠杆菌中的表达
• 2.2.4 多克隆抗体的制备
• 2.2.5 鲤IGF-I在毕赤酵母中的表达
• 3 结果与分析
• 3.1 鲤肝脏总RNA的提取
• 3.2 鲤IGFs的PCR扩增
• 3.3 重组载体的鉴定
• 3.4 原核表达及其产物纯化
• 3.5 多克隆抗体的效价与特异性分析
• 3.6 酵母菌转化子的筛选鉴定
• 3.7 酵母表达产物的电泳检测和免疫学分析
• 4 讨论
• 4.1 鲤IGFs在大肠杆菌中的表达
• 4.1.1 鱼类IGFs的原核表达及其载体的选择
• 4.1.2 包涵体的提取与纯化
• 4.2 抗血清制备的意义
• 4.3 鲤IGF-I在毕赤酵母中的表达
• 4.3.1 酵母表达菌株与载体的选择
• 4.3.2 重组子Mut表型筛选的意义
• 4.3.3 小分子多肽的SDS-PAGE电泳
• 5 小结
• 参考文献
• 致谢