黑曲霉纤维二糖酶基因在酵母细胞中的表达

论文摘要

纤维二糖酶(CB)是纤维素酶的重要组分之一,在纤维素酶协同水解纤维素过程中发挥着重要的作用。目前工业生产的纤维素酶制剂CB活力较低,不利于纤维素的水解糖化。为促进纤维素酶对纤维素的水解,提高纤维素酶系中CB活力就具有重要意义。本文研究了黑曲霉(Aspergillus niger)纤维二糖酶基因(bgl)在酵母中的表达,在摇瓶中对产酶条件进行了优化,并探讨了重组酵母表达的CB协同里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶水解纤维素的能力。使用整合型质粒在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达黑曲霉bgl基因。使用遗传霉素(G418)筛选得到7株转化子,PCR验证表明转化子的基因组中都已整合入bgl基因,但酒精发酵试验表明,酿酒酵母转化子不能利用纤维二糖产酒精,发酵液中也检测不到CB活力。造成这种结果的原因可能是酿酒酵母对CB过糖基化修饰而使其失活。在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用pPIC9K表达了黑曲霉bgl基因,通过G418筛选得到一株高拷贝转化子。对高拷贝转化子的PCR验证结果表明,黑曲霉bgl基因以插入的形式整合入毕赤酵母基因组中,酵母本身的醇氧化酶Ⅰ基因没有被破坏,所以转化子可高效利用甲醇。酶活验证试验表明转化子能分泌表达有活力的CB。蛋白电泳的结果显示,毕赤酵母表达的CB的分子量约为130kD,比黑曲霉CB高出10kD。虽然在分子量上有差异,但毕赤酵母表达的CB与黑曲霉CB的最适温度和最适pH值是一致的。研究了重组毕赤酵母在复合诱导(BMMY)培养基和葡萄糖玉米浆粉(YG)培养基中的产酶效果,并对发酵条件进行了优化。结果表明,采用BMMY培养基为产酶培养基时,在优化后的条件下,重组酵母发酵8d后发酵液中CB活力为11.8 IU/mL,是优化前的1.37倍。而在YG培养基中,重组酵母在优化后的条件下发酵8d发酵液中CB活力为9.01IU/mL。虽然重组酵母在BMMY培养基中的酶产量要高于在YG培养基中的酶产量,但后者具有成本低和操作简便的优势,所以更适合作为重组毕赤酵母的产酶培养基。以稀酸预处理的玉米芯纤维残渣为底物研究了毕赤酵母表达的CB协同里氏木霉纤维素酶水解纤维素的能力。结果表明,毕赤酵母表达的CB与黑曲霉CB在协同纤维素酶水解纤维素的能力上没有差别,通过添加CB,酶解得率从62.4%提高到80.7%。对酶解参数进行了优化,在优化后的条件下酶解72h,酶解得率达到了93.1%。但适宜的酶解时间为48h。本文将黑曲霉纤维二糖酶基因转入毕赤酵母细胞中,并成功地实现了胞外高效表达,有关研究结果对于在液体深层发酵条件下大规模生产纤维二糖酶、提高纤维素酶的协同降解性能、以及促进纤维素乙醇的产业化进程等方面具有重要意义。

论文目录

• 致谢
• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 概述
• 1.2 纤维素酶
• 1.2.1 纤维素酶的组成
• 1.2.2 纤维素酶协同作用机制
• 1.2.3 纤维素酶的来源
• 1.2.4 里氏木霉纤维素酶
• 1.3 纤维二糖酶
• 1.3.1 黑曲霉纤维二糖酶
• 1.3.1.1 黑曲霉纤维二糖酶的性质
• 1.3.1.2 黑曲霉纤维二糖酶的作用底物
• 1.3.1.3 纤维二糖酶的作用机制
• 1.3.1.4 纤维二糖酶活性中心结构
• 1.3.1.5 纤维二糖酶的抑制和激活
• 1.3.2 纤维二糖酶的应用
• 1.3.2.1 在食品领域中的的应用
• 1.3.2.2 在医药领域中的应用
• 1.3.2.3 纤维二糖酶的其他应用
• 1.4 纤维二糖酶在酵母系统中的异源表达
• 1.4.1 酿酒酵母表达系统
• 1.4.2 纤维素酶基因在酿酒酵母中的表达
• 1.4.3 毕赤酵母表达系统
• 1.4.3.1 影响毕赤酵母表达的因素
• 1.4.4 纤维素酶基因在毕赤酵母中的表达
• 1.5 本课题思路
• 第二章 黑曲霉纤维二糖酶基因在工业酿酒酵母中的表达
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 实验方法
• 2.1.4.1 PCR反应
• 2.1.4.2 酶切与连接
• 2.1.4.3 T质粒载体连接
• 2.1.4.4 质粒载体的构建
• 2.1.4.5 质粒的线性化
• 2.1.4.6 大肠杆菌的转化
• 2.1.4.7 酿酒酵母电转化
• 2.1.4.8 遗传酶素抗性的验证
• 2.1.4.9 酵母发酵产酒精策略
• 2.1.4.10 发酵液成分测定
• 2.1.4.11 SDS-PAGE
• 2.1.4.12 蛋白浓缩
• 2.1.4.13 纤维二糖酶（CB）活力的测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 PYXK212的构建
• 2.2.2 PYXK212T的构建
• 2.2.3 PYXK212T-αbgl的构建
• 2.2.4 PYXK212TI-αbgl的构建
• 2.2.5 酿酒酵母电转化及转化子筛选
• 2.2.6 酿酒酵母转化子的PCR验证
• 2.2.7 转化子酒精发酵实验
• 2.2.8 SDS-PAGE验证及酶活分析
• 结论
• 第三章 黑曲霉纤维二糖酶基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 实验方法
• 3.1.4.1 PCR反应
• 3.1.4.2 酶切与连接
• 3.1.4.3 T质粒载体连接
• 3.1.4.4 质粒的线性化
• 3.1.4.5 质粒载体的构建
• 3.1.4.6 大肠杆菌的转化
• 3.1.4.7 毕赤酵母的转化
• 3.1.4.8 毕赤酵母高拷贝转化子的筛选
• 3.1.4.9 毕赤酵母基因组的提取
• 3.1.4.10 毕赤酵母转化子的验证
• 3.1.4.11 外源蛋白表达策略
• 3.1.4.12 SDS-PAGE
• 3.1.4.13 纤维二糖酶（CB）活力的测定
• 3.1.4.14 重组酶最适温度和最适pH的测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 pPIC9K-bgl的构建
• 3.2.2 毕赤酵母的转化及重组子的筛选
• 3.2.3 高拷贝转化子NPP1的PCR验证
• 3.2.4 NPP1表达黑曲霉bgl基因的验证及SDS-PAGE
• 3.2.5 NPP1产酶时间进程
• 3.2.6 重组酶最适温度和最适pH
• 结论
• 第四章 重组毕赤酵母发酵产纤维二糖酶的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 实验方法
• 4.1.4.1 两步法发酵产酶实验
• 4.1.4.2 一步法发酵产酶实验
• 4.1.4.3 菌落计数
• 4.1.4.4 纤维二糖酶（CB）活力的测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 两步法发酵条件优化
• 4.2.1.1 诱导前菌体浓度的影响
• 4.2.1.2 甲醇浓度的影响
• 4.2.1.3 pH的影响
• 4.2.1.4 两步发酵法时间进程
• 4.2.2 一步发酵法条件优化
• 4.2.2.1 葡萄糖浓度对产酶的影响
• 4.2.2.2 玉米浆粉对产酶的影响
• 4.2.2.3 pH的影响
• 4.2.2.4 甲醇浓度的影响
• 4.2.2.5 混合补料
• 4.2.2.6 重组酵母发酵产酶进程
• 结论
• 第五章 纤维二糖酶在纤维素水解中的协同作用研究
• 引言
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 纤维原料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 酶制剂
• 5.1.4 实验方法
• 5.1.4.1 酸处理
• 5.1.4.2 纤维物料成分测定
• 5.1.4.3 酶活力测定
• 5.1.4.4 还原糖含量的测定
• 5.1.4.5 批次酶解
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 稀酸预处理前后玉米芯成分分析
• 5.2.2 CB协同纤维素酶水解纤维素效果比较
• 5.2.3 批式酶解工艺参数的优化
• 5.2.3.1 酶系组成的影响
• 5.2.3.2 非离子型表面活性剂对酶解的影响
• 5.2.3.3 微量元素对酶解的影响
• 5.2.4 纤维素酶协同水解玉米芯残渣的时间进程
• 结论
• 第六章 结论与建议
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录