绵羊骨骼肌卫星细胞的体外培养和诱导分化

论文摘要

骨骼肌卫星细胞是成体肌源性干细胞,在各种成体干细胞研究中越来越受到人们的关注。虽然从一些物种（如小鼠、大鼠和人）的骨骼肌中已经成功分离出卫星细胞,但对于家畜（如牛、绵羊）的研究却很少。在家畜转基因的研究和生产过程中,需要在动物生产之前对转基因细胞系进行基因表达的鉴定和验证。因此,家畜骨骼肌卫星细胞体外培养模型的建立就显得特别迫切和重要。本研究以绵羊骨骼肌卫星细胞作为研究对象,重点探讨卫星细胞的分离、纯化及体外培养方法,并对得到的细胞进行鉴定,旨在建立可稳定传代的绵羊卫星细胞系及其鉴定方法,为今后绵羊骨骼肌卫星细胞在家畜繁育和再生医学等相关方面的研究和应用提供实验依据。用两步酶消化法和差速贴壁法分离和纯化绵羊骨骼肌卫星细胞,并对其进行鉴定和诱导分化,分析其多能性。结果表明,1.1%Ⅰ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶两步消化法分离绵羊骨骼肌卫星细胞效率较高,含20%FBS+10%马血清的培养基更有利于绵羊骨骼肌卫星细胞的体外培养。用免疫组化和流式细胞术检测绵羊骨骼肌卫星细胞中几个标记基因Desmin、α-SarcOmeric Actinin、MyOD1、Myf5和PAX7的表达情况,本研究得到的细胞中这5个基因表达均呈阳性,说明分离得到的细胞为绵羊骨骼肌卫星细胞。为验证其多能性,将分离得到的卫星细胞向成肌、成脂和成骨三个方向诱导。成肌诱导后形成明显的多核肌管细胞,标记基因MyoG表达阳性,快肌肌球蛋白细胞免疫荧光染色呈阳性；成骨诱导后经茜素红和ALP染色细胞均呈阳性,成骨细胞特异性基因Osteocalcin表达阳性；成脂诱导后细胞周围有明显的脂滴出现,经0-油红染色呈阳性,且PPARy2表达呈阳性。说明本实验得到的细胞具有一定的多能性。本研究初步建立了绵羊骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化、培养和鉴定的方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 绵羊骨骼肌卫星细胞的体外培养
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 实验动物
• 1.3 实验试剂及耗材
• 1.4 培养液
• 2 实验方法
• 2.1 采用两步酶消化法分离绵羊MDSCs及用差速贴壁法对其进行纯化
• 2.1.1 两步酶消化法分离绵羊MDSCs
• 2.1.2 差速贴壁法纯化绵羊MDSCs
• 2.2 绵羊DMSCs的冷冻保存及复苏
• 2.3 绵羊MDSCs生长曲线测定
• 2.4 绵羊MDSCs免疫荧光染色及RT-PCR鉴定
• 2.4.1 Desmin,a-Sarcomeric Actinin,MyoD1,Myf5和PAX7的免疫组化检测
• 2.4.2 RT-PCR检测细胞内Myf5和MyoD1的表达
• 2.4.2.1 细胞总RNA提取
• 2.4.2.2 RT-PCR反应检测Myf5和MyoD1的表达
• 2.5 流式细胞术检测绵羊MDSCs
• 2.6 绵羊MDSCs染色体数目分析
• 3 结果
• 3.1 绵羊MDSCs的分离与纯化
• 3.2 绵羊MDSCs生长曲线
• 3.3 绵羊MDSCs免疫荧光染色及RT-PCR鉴定
• 3.4 绵羊MDSCs流式细胞仪检测
• 3.5 绵羊MDSCs染色体数目分析
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二章 绵羊骨骼肌卫星细胞诱导分化
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 实验材料
• 1.3 主要试剂及耗材
• 1.4 液体培养基
• 2 方法
• 2.1 绵羊MDSCs成肌诱导与鉴定
• 2.1.1 免疫组化检测Myosin
• 2.1.2 RT-PCR鉴定标记基因的表达
• 2.2 绵羊MDSCs成骨诱导与鉴定
• 2.2.1 Alizarin Red染色
• 2.2.2 ALP活性检测
• 2.2.3 RT-PCR鉴定标记基因的表达
• 2.3 绵羊MDSCs成脂诱导与鉴定
• 2.3.1 Oil Red-O染色
• 2.3.2 RT-PCR鉴定标记基因的表达
• 3 结果
• 3.1 绵羊MDSCs成肌诱导
• 3.2 绵羊MDSCs成骨诱导
• 3.3 绵羊MDSCs成脂诱导
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间已发表学术论文