靶向AURKA的siRNA抑制喉癌HEp-2细胞生长的体内外研究

论文摘要

目的：研究Aurora激酶A （Aurora Kinase A, AURKA）在喉鳞状细胞癌中的表达及其临床意义,研究AURKA基因沉默在体外体内对喉癌HEp-2细胞生长的影响及其机制。方法：收集37例喉鳞状细胞癌组织和邻近正常组织,应用实时荧光RT-PCR和Western blot技术检测AURKA mRNA和蛋白在喉癌及邻近正常组织中的表达,分析AURKA mRNA和蛋白与喉癌临床病理特征的关系。构建针对AURKA的shRNA表达质粒并转染喉鳞癌细胞株HEp-2细胞,检测HEp-2细胞转染前后AURKA mRNA和蛋白表达,CCK-8实验检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭,软琼脂实验观察克隆形成能力,流式细胞术检测细胞周期分布、凋亡和有丝分裂监控点,免疫荧光实验观察细胞间桥、多极纺锤体和多中心体等染色体不稳定性事件,Western blot检测细胞粘附和迁移的重要因子粘着斑激酶（FAK）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白表达。另外,将AURKA基因敲除的HEp-2细胞（HEp-2-S）接种于裸鼠,观察裸鼠移植瘤生长情况以及瘤体内FAK和MMP-2的表达,最后,将AURKA抑制剂VX-680注射入荷瘤裸鼠,观察VX-680对肿瘤生长的影响。结果：32例（86.5%）病人肿瘤中的AURKA mRNA高于相应的喉正常黏膜,AURKA mRNA在喉癌组织中表达上调,显著高于喉正常黏膜组织中的表达。25对喉癌组织及其喉正常黏膜中,其中有16个（64.0%）病例AURKA蛋白T/N比值>1.2,提示在喉癌组织中AURKA蛋白呈高表达。AURKA mRNA上调和蛋白的高表达与患者颈部淋巴结转移显著相关,AURKA mRNA还与临床Ⅲ/Ⅳ分期显著相关,而与患者性别、年龄、肿瘤部位、T分期和病理分级无相关性。喉癌HEp-2细胞中AURKA蛋白也呈高表达。HEp-2细胞转染AURKA shRNA后,AURKA mRNA和蛋白表达明显下降。AURKA沉默后,抑制HEp-2细胞增殖活性、侵袭和克隆形成能力,以及裸鼠体内成瘤能力,使HEp-2细胞停滞于G2/M期,最终细胞凋亡；同时,AURKA沉默后,HEp-2细胞有丝分裂监测点被激活,减少HEp-2细胞染色体的不稳定性；此外,AURKA沉默后,在体外体内实验中,粘着斑激酶（FAK）、磷酸化FAK和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达降低；最后,单独使用VX-680注射入荷瘤裸鼠,肿瘤生长虽然有所减慢,但是与对照组相比差异无显著性。结论：在喉鳞状细胞癌中AURKA呈高表达,与颈部淋巴结转移和Ⅲ/Ⅳ分期相关,AURKA基因沉默在体外体内均能抑制喉癌HEp-2细胞的生长和侵袭,并与FAK、磷酸化FAK和MMP-2表达降低有关,本研究为靶向AURKA的喉癌基因治疗提供重要的理论依据。

论文目录

• 全文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 AURKA在喉鳞癌中的表达及其与临床病理特征的关系
• 第一节 材料和方法
• 第二节 结果
• 第三节 讨论
• 第四节 结论
• 第二部分 AURKA基因沉默对喉鳞癌HEp-2细胞生长的体外研究
• 第一节 材料和方法
• 第二节 结果
• 第三节 讨论
• 第四节 结论
• 第三部分 AURKA基因沉默对喉鳞癌HEp-2细胞生长的体内研究
• 第一节 材料和方法
• 第二节 结果
• 第三节 讨论
• 第四节 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢