大庆油田总医院163001
摘要：目的探讨研究肝癌细胞中XAGE-1b基因的表达。方法选择在2010年10月～2014年10月入住我院接受治疗的64例肝癌患者的肝癌组织及癌旁组织为研究对象，通过Real-timePCR法进行检测和分析。结果XAGE-1b基因在肝癌组织与在癌旁组织中表达值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论XAGE-1b可作为肝癌诊断的标记物，建议与AFP检测联合应用。
关键词：肝癌；XAGE-1b；PCR；表达
原发性肝癌（PHC）病情危重，发病率较高，目前关于该病的病因和发病机制尚未明确，普遍认为与肝硬化、病毒性肝炎和黄曲霉素等致癌物质、环境因素有关，患者表现有肝区疼痛，消瘦乏力，食欲不振等症状，而近年来针对原发性肝癌研发了多种治疗的新技术和新方法，但仍有60%左右的患者会出现复发和转移，以往肝癌检查都是采用肝癌学前标记物如AFP检测，或者影像学检查，存在一定的不足之处，本实验旨在通过RT-PCR法分析XAGE-1b在肝癌细胞中的表达情况，来确定XAGE-1b能否作为PHC诊断及预后的依据。
1资料与方法
1.1仪器与试剂荧光实时定量PCR反应仪：Ftc-2000（上海枫岭生物技术公司）；微量移液器（Gilson公司）；离心机（Eppendorf5415D）；凝胶成像分析仪（上海复日公司）；石蜡切片机（RM2145，LEICA公司）；试剂盒（上海近岸科技有限公司），逆转录试剂盒（广州泛思生物技术科技有限公司）；普通PCR反应试剂（包括Tap酶、dNTP，Buffer等）（上海申能博采公司）。TaqMan-MGB荧光探针及其相应的PCR反应引物（上海基康生物技术公司）。
1.2标本来源2010年10月～2014年10月大庆油田总医院收治的病理证实为原发性肝癌患者共64例，其中男38例，女26例，年龄34～72岁，分别取手术切除30min内的癌组织和癌旁组织（距肝癌组织>1cm）为样本，置于预装RNAlater保存液的冻存管中，封口编号备用。
1.3实验步骤按传统一步法提取组织样本中的总RNA，以12%琼脂糖凝胶电泳抽样检验其质量。提取出RNA后使用反转录试剂盒制备cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，以GAPDH为内参基因。总反应体系20μL，其中探针（20mmol/L）0.5μL，引物（20mmol/L）0.9μL，Mix10μL（PCR试剂盒，日本TOYOBO公司），标本组织cDNA2μL，H20补至20μL，每个样品的目的基因与内参基因各设3个重复实验。XAGE-1b与GAPDH分别在相应的反应条件下进行PCR检测。每次反应均设置空白对照组及用于绘制标准曲线的6个梯度的标准样品反应混合物，标准样品反应混合物由复旦大学病毒与分子免疫学实验室制备提供。PCR反应结束后，计算机自动获取标本中XAGE-1b和GAPDH的Ct值，对照标准曲线计算每个样本XAGE-1b和GAPDH基因的拷贝数。结果以XAGE-1b和GAPDH基因拷贝数的比值表示相对表达量。
1.4统计学方法应用SPSS18.0统计学软件，采用χ2检验或秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
抽提RNA检验结果见图1，在16ssRNA和28ssRNA条带明亮、清晰，证明所得样品质量优良。自64例肝癌组织和癌旁组织抽提的RNA经PCR检测，结果显示肝癌组织表达量为2015×105，高于癌旁组织的表达量147×105，两组比较存在显著性差异（P<0.05）。XAGE-1b基因表达与患者的年龄、性别无相关性（P>0.05）。
3讨论
肝癌属于在世界范围内发病率较高的恶性肿瘤，对人民的身心健康危害严重。由于肝癌早期的症状并不确切，而症状明显时已发展为中晚期肝癌，因而临床医师们针对肝癌的早期诊断展开长期的实验研究。肝癌患者确诊后可以通过外科手术或者化疗等手段进行治疗，目前已取得一定的成绩，但值得一提的是很多肝癌患者会出现癌细胞的复发和转移，为了改善肝癌患者的预后也应及早诊断和发现转移。自20世纪以来分子生物学技术得到长足的发展，加上人类基因组计划的支持，使得临床工作者得以通过对肝癌细胞记忆的分析来探索更加灵敏和准确的肿瘤标记物，达到早期诊断的目的，借助于肿瘤标志物的检测结果可以进行针对性化疗，降低非必要的化疗引起的毒副作用。
到目前为止临床中应用过多种肿瘤标志物如CEA、AFP、AFU等来诊断PHC，这些标志物各有其优势和不足，国内外专家近年来对XAGE-1b基因进行了深入研究，并且获得了XAGE-1b在肿瘤中较为详细的表达谱[1]。经证实XAGE-1b基因在肺癌、前列腺癌的癌组织中表达率较高，并且与肿瘤亚型和分期有一定的关联，郭成等研究了四类XAGE-1异构体在肝癌中的表达情况，结果显示XAGE-1b基因在肝癌组织中大量表达。目前由于缺少大样本的实验和长期随访，关于XAGE-1b在PHC中表达的研究仍处于小范围和小样本的初期阶段，其检测结果的局限性在所难免，而且XAGE-1b能够区分肿瘤细胞与非肿瘤细胞，良性与恶性肿瘤，但是难以区分具体的组织来源或病理类型的肿瘤，因此建议与AFP等肿瘤标志物检测相结合，通过综合分析进行研究，对于提高肝癌的确诊率有积极的促进作用[2]。
RT-PCR方法具有检测时间短（<3h），特异性和敏感性高的特点，可以从复杂的样品中检测出微量的目标核酸，目前证实可用于淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体的定量测定。定量PCR的应用可了解微转移瘤细胞的数量，通过数量的变化可以观察辅助治疗的疗效，从而为临床筛选化疗药物及治疗方法提供依据，鉴于以上优点，该技术已广泛应用于临床诊断。缺点是存在假阳性风险，操作过程中需要注意的是严格的无菌环境和防止mRNA的降解。本研究证实了XAGE-1基因在肝癌的诊断中能够较好地反映肿瘤细胞的播散程度，敏感性和特异性良好，为治疗方法的选择和疗效的评价提供依据，改变肝癌筛选的传统方法，显著改善肝癌的及早发现和诊断，提高肝癌患者的生存率和生活质量。
参考文献：
[1]吴涛，李中文，鲍明升.XAGE-1b基因在肝癌细胞中的表达[J].求医问药（下半月），2013，（06）.
[2]朱江，江福能，戴奇山，等.肝癌细胞中XAGE-1b的表达和意义[J].中国现代医学杂志，2012，（20）.