GGCX在原发性膝关节骨性关节炎软骨中的表达及其意义

论文摘要

研究目的：探讨GGCX在原发性膝关节骨性关节炎软骨中的表达及其对正常软骨细胞的生物学作用,从而为探讨其在骨性关节炎中的作用机制奠定基础。研究方法：收集20例原发性膝关节骨性关节炎和20例正常膝关节的关节软骨及关节液,对软骨进行固绿-番红O染色后进行组织学观察,并根据改良的Mankin评分标准对骨性关节炎关节软骨进行分组。应用免疫组化的方法检测GGCX在各组软骨组织中的表达,使用RT-PCR方法检测各组软骨组织中GGCX mRNA的表达,通过western blot检测各组软骨组织中GGCX蛋白的表达,应用磁分离化学发光免疫检测法对关节液中GGCX的含量进行检测,所有数据均应用SPSS19.0软件进行统计学分析。取正常膝关节的关节软骨进行软骨细胞的分离及培养,并应用甲苯胺蓝染色和II型胶原纤维染色对软骨细胞进行鉴定。根据人GGCX mRNA序列,在线设计了三段siRNA序列,并在体外转录合成,利用LipofectamineTM2000将其转染至培养的软骨细胞,应用荧光镜检测转染效率,并使用RT-PCR方法分别检测三段siRNA转染后软骨细胞中GGCX mRNA的表达,通过western blot方法分别检测三段siRNA转染后软骨细胞中GGCX蛋白的表达,比较三段siRNA对软骨细胞中GGCX的干扰效率,选择干扰效率最高的siRNA片段进行干扰试验。应用干扰效率最高的siRNA片段对正常软骨细胞进行转染,研究干扰正常软骨细胞中GGCX表达对软骨细胞生物学的影响。使用MTT法检测转染后软骨细胞的的增殖率,通过Annexin V-FITC&PI法检测软骨细胞的凋亡率,应用RT-PCR方法检测软骨细胞中MMP13、X型胶原、碱性磷酸酶mRNA的表达,western blot检测软骨细胞中MMP13、X型胶原、碱性磷酸酶的蛋白表达,所有数据均应用SPSS19.0进行统计学分析。研究结果：GGCX在正常膝关节和原发性膝关节骨性关节炎的关节软骨中均有表达,其主要位于软骨细胞的胞浆中,免疫组化的结果显示GGCX的表达在骨性关节炎软骨中明显低于正常膝关节的关节软骨（P<0.05）, RT-PCR及western blot的结果同样提示原发性骨性关节炎软骨中GGCX mRNA表达及蛋白含量均显著低于正常膝关节软骨（P<0.05）,而且随着骨性关节炎严重程度的提高,GGCX的表达、蛋白含量及mRNA均逐步降低,在轻度、中度、重度骨性关节炎软骨中这些差异都具有统计学意义（P<0.05）。原发性膝关节骨性关节炎组关节液中GGCX的含量明显低于正常组（P<0.05）。为了进一步探讨GGCX对正常软骨细胞生物学的影响,我们成功设计、合成了siRNA,并将其成功地转染至培养的软骨细胞,RT-PCR和western blot都显示我们设计的siRNA能显著干扰GGCX的表达,并以siRNA片段2291干扰效率最高,随后再对干扰了GGCX表达的软骨细胞进行检测分析,结果显示：MMP13、X型胶原、碱性磷酸酶的蛋白表达及mRNA都显著高于未干扰组及无意义对照组（P<0.05）；干扰了GGCX的软骨细胞在早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率方面均明显高于未干扰组及无意义对照组（P<0.05）；软骨细胞干扰组、无意义对照干扰组在0、12、24小时的细胞增殖率相对正常培养组没有明显升高（P>0.05）,但干扰GGCX表达的软骨细胞在48、72小时的增殖率显著升高（P<0.05）。结论：1、原发性膝关节骨性关节炎的软骨中GGCX的表达较正常软骨显著降低,并且软骨退变程度越重,GGCX表达亦越低；2、原发性膝关节骨性关节炎组关节液中GGCX的含量明显低于正常组；3、干扰GGCX后可以增加软骨细胞MMP13、X型胶原、碱性磷酸酶的表达；4、干扰GGCX后可显著增加软骨细胞的凋亡率；5、干扰GGCX表达的软骨细胞在48、72小时的增殖率明显升高；

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词表
• 前言
• 第一章 γ-谷氨酰基羧化酶在原发性膝关节骨性关节炎关节软骨中的表达
• 前言
• 第一节 材料与方法
• 1.1 患者资料与标本
• 1.2 主要试剂及仪器设备
• 1.3 实验步骤与方法
• 1.4 统计学处理
• 第二节 结果
• 2.1 固绿-番红O染色组织学观察
• 2.2 GGCX在骨性关节炎软骨中的表达
• 2.3 关节液中GGCX的含量
• 第三节 讨论
• 第二章 GGCX siRNA的设计、转染及鉴定
• 前言
• 第一节 材料与方法
• 1.1 标本来源
• 1.2 主要试剂及仪器设备
• 1.3 实验方法
• 1.4 统计学计算
• 第二节 结果
• 2.1 正常软骨细胞的分离、培养与鉴定
• 2.2 GGCX siRNA序列的设计、合成及转染
• 2.3 GGCX siRNA转染软骨细胞后对GGCX蛋白表达及mRNA表达的影响
• 第三节 讨论
• 第三章 GGCX siRNA对正常软骨细胞的生物学影响
• 前言
• 第一节 材料与方法
• 1.1 主要试剂及仪器设备
• 1.2 实验步骤与方法
• 1.3 统计学计算
• 第二节 结果
• 2.1 细胞凋亡检测
• 2.2 MMP13、collagen X、ALP mRNA表达水平检测
• 2.3 western blot检测
• 2.4 细胞增殖能力的检测
• 第三节 讨论
• 3.1 软骨细胞凋亡与骨性关节炎
• 3.2 肥大软骨细胞与骨性关节炎
• 3.3 MGP、GGCX与骨性关节炎
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读博士期间的主要研究成果
• 致谢