产谷氨酰胺转胺酶菌株的鉴定及其诱变选育研究

论文摘要

谷氨酰胺转胺酶由于可以催化蛋白质分子内或分子间发生交联,从而改善蛋白质食品的特性,在食品工业中有非常高的应用价值。本研究通过从土壤中筛选出产酶菌株和对产酶菌株的诱变选育,以期获得有较高产酶能力的菌株。另外也试图通过基因工程的手段在大肠杆菌中大量表达谷氨酰胺转胺酶。从土壤中筛选得到一株产谷氨酰胺转胺酶的菌株H-197 ,并根据菌株形态、培养特征、生理生化特性以及16S rDNA序列等进行多项分类研究。首先发现该菌株具有典型的链霉菌属的形态学特征,并在16S rDNA序列比较分析的基础上,综合形态特征、培养特征及生理生化特性,根据多项分类原则初步判定该菌株为链霉菌属吸水类群中的吸水链霉菌。另外,通过比较分析H197菌株的TG基因与链霉菌属内的其他TG基因的序列,结果表明H197的TG基因与吸水链霉菌的TG具有最高的相似性,这也说明H-197菌株和吸水链霉菌的同源性最高。以H197为原始出发菌株（谷氨酰胺转胺酶酶活为0.34 u/mL）,经过2轮紫外线重复诱变,通过凝胶法初筛产酶菌株和酶活测定复筛产酶菌株,筛选得到一株产酶能力明显提高的突变株（酶活为1.25u/mL）,酶活比出发菌株提高了3.68倍。从产酶菌株H197中获得其基因组DNA ,通过特异性的引物扩增出谷氨酰胺转胺酶（transglutaminase ,TG）全长产酶基因并进行测序分析。通过对基因序列的分析发现,谷氨酰胺转胺酶基因全长1257bp,编码418个氨基酸,预计蛋白分子量为47 kD,等电点pI为7.08,其中GC含量为61.4%。选取BamHI,HindⅢ为制造粘性末端的限制性内切酶。并得到了加有酶切位点接头的目的基因片段,连接到表达载体pET-28a,得到了转化子。但目的基因与载体是否正确连接以及目的基因是否发生突变还需进一步的测序验证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 国内外研究概况
• 1.2.1 谷氨酰胺转胺酶的来源及获取的方法
• 1.2.2 谷氨酰胺转胺酶的结构，性质及催化机理
• 1.2.3 谷氨酰胺转胺酶的催化机理
• 1.2.4 谷氨酰胺转胺酶在食品工业上的应用
• 1.2.5 微生物谷氨酰胺转胺酶产生菌和诱变育种
• 1.2.6 微生物谷氨酰胺转胺酶基因克隆和表达研究进展
• 1.3 立题的背景及意义
• 1.4 课题研究内容
• 第二章 产谷氨酰胺转胺酶菌株H197 的初步鉴定研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 普通培养基（鉴定培养基见附录B）
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 缓冲液及试剂的配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 形态学特征，培养特征和生理生化特性
• 2.2.2 16S rDNA 序列分析
• 2.2.3 构建系统发育树
• 2.3 结果
• 2.3.1 形态学特征，培养特征和生理生化特性结果
• 2.3.2 16S rDNA 序列结果
• 2.3.3 构建系统发育树
• 2.4 结论
• 第三章 产谷氨酰胺转胺酶菌株的诱变选育研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 主要培养基
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 诱变方法
• 3.2.2 初筛方法
• 3.2.3 复筛方法
• 3.2.4 酶活的测定
• 3.2.5 遗传稳定性实验
• 3.2.6 CJ3033 菌株的MTG 基因的扩增和回收
• 3.2.7 CJ3033 菌株的MTG 基因的测序
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 培养基对菌株产孢能力的影响
• 3.3.2 酶活测定的标准曲线绘制和酶活测定公式
• 3.3.3 诱变路线及结果
• 3.3.4 UV 处理时间对菌体生长的影响
• 3.3.5 高产酶菌株的遗传稳定性
• 3.3.6 高产酶菌株的菌种性能分析
• 3.3.7 CJ3033 突变株MTG 基因及蛋白质序列分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 紫外诱变效果分析
• 3.4.2 诱变剂量的选择
• 3.4.3 选育过程分析
• 3.4.4 筛选方法分析
• 3.4.5 遗传稳定性实验
• 3.5 结论
• 第四章 谷氨酰胺转胺酶基因克隆与载体构建初步研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株、质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 酶、化学试剂
• 4.1.4 缓冲液的配制及抗生素的浓度
• 4.1.5 PCR 扩增用的引物
• 4.2 方法
• 4.2.1 总DNA 的提取及其检测
• 4.2.2 MTG 目的基因的 PCR 扩增
• 4.2.3 PCR 产物电泳检测及回收扩增的DNA 片段
• 4.2.4 提取质粒DNA
• 4.2.5 MTG 基因片段和质粒的双酶切
• 4.2.6 对双酶切产物进行回收
• 4.2.7 将双酶切后的目的基因和质粒进行连接反应
• 4.2.8 制备感受态细胞
• 4.2.9 将重组质粒pET-28a 导入E.coli DH5α感受态细胞
• 4.2.10 提取重组质粒：采用质粒的碱裂解小量提取法
• 4.2.11 转化子的PCR 鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 基因组总DNA 提取结果
• 4.3.2 H197 菌株的MTG 基因的基因克隆
• 4.3.3 MTG 基因和pET-28a 载体分别双酶切回收后电泳检测
• 4.3.4 转化子的PCR 鉴定
• 4.4 讨论
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录A：攻读硕士学位期间发表的文章
• 附录B：鉴定培养基的配方