嗜水气单胞菌成膜相关基因鉴定及其功能研究

论文摘要

细菌常以生物膜的状态存在于自然界,即附着在物体表面并有胞外多聚物包裹的微生物群体。近年,许多研究表明绝大多数细菌具有形成生物膜的能力。与浮游细菌相比,细菌形成生物膜后不仅具有浮游的菌体细胞本身所有的毒力特性,还可抵御宿主免疫系统和抗菌药物的杀伤作用,从而产生对抗菌药物比浮游菌高达1000倍的高度耐药性,导致感染难以清除,给人类的生产生活带来了严重危害,因此研究病原菌生物膜已成为热点主题。应用改良的微孔板法研究了致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11的生物膜形成特性。结果表明,嗜水气单胞菌B11能在聚苯乙烯酶标板表面形成稳定而明显的生物膜;其生物膜的形成能力受温度、酸碱度、起始菌液浓度、钙、镁离子浓度等因素的影响;肌肉组织提取液也存在能影响生物膜形成的成分。本研究在上述结果的基础上,采用转座子标签技术,即通过转座子（mini-Tn10）随机插入突变构建了嗜水气单胞菌B11突变库,从中筛选到2株成膜缺陷稳定的突变菌株B188和B212。为了确证突变性状是单位点突变,根据标签序列设计两对引物,其中一对用于PCR鉴定,另一对用于扩增Southern杂交所需要的特异探针。鉴定结果显示,变株为转座子单位点插入引起的突变。再采用热不对称PCR（包括Tail-PCR和Actail-PCR）扩增转座子插入位点侧翼基因序列。扩增序列的测序结果在基因库中进行同源比对结果显示,突变菌株B188中突变基因与GenBank中已知嗜水气单胞菌A.hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966的细胞色素c4（Cyt c4）基因同源性为92%;与杀鲑气单胞菌A.salmonicida subsp. salmonicida A449的细胞色素c4（Cyt c4）基因同源性为88%,可以确认B188突变菌株中的突变基因为细胞色素c4（Cyt c4）基因;突变菌株B212部分序列比对结果显示,该序列与嗜水气单胞菌A.hydrophila ATCC 7966的菌毛合成相关基因（MshQ）的同源性为90%,与杀鲑气单胞菌A.salmonicida subsp. salmonicida A449的菌毛合成相关基因（MshQ）的同源性为88%,上述分析结果显示,该突变基因为菌毛合成相关基因（MshQ）。最后研究了突变株在生长、早期黏附及吞噬细胞内存活能力等方面的生物学特性。结果发现,与野生型菌株相比,B188突变株在生长、粘附及胞内存活能力均明显降低;B212突变株在生长性能上与野生型菌株没有显著差异,粘附能力和胞内存活能力也明显低于野生型菌株。研究表明,病原性嗜水气单胞菌B11可形成明显的生物膜,Cyt c4基因和MshQ基因均与其生物膜形成相关,这两个基因突变后该菌的生长、粘附及胞内存活等方面的生物学特性发生了不同程度的改变,而这些生物学特性与该菌致病性密切相关,说明形成生物膜可能也是嗜水气单胞菌的毒力因子之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 嗜水气单胞菌研究概述
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 嗜水气单胞菌研究现状
• 1.2 生物膜研究现状
• 1.2.1 生物膜形态观察
• 1.2.2 生物膜形成调控机制研究
• 1.2.3 耐药性机制研究
• 1.3 转座子和转座子标签技术
• 1.3.1 转座子
• 1.3.2 转座子标签诱变技术
• 1.3.3 Mini-Tn10的转座诱变机制
• 1.4 主要研究内容和本研究的意义
• 第2章 致病性嗜水气单胞菌生物膜的形成特性
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株及培养条件
• 2.1.2 生物膜的形成与测定
• 2.1.3 不同培养时间的生物膜测定
• 2.1.4 不同初始菌液浓度的生物膜测定
• 2.1.5 不同培养温度的生物膜测定
• 2.1.6 不同pH 值对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响
• 2+、Mg²⁺对于嗜水气单胞菌生物膜形成的影响'>2.1.7 Ca²⁺、Mg²⁺对于嗜水气单胞菌生物膜形成的影响
• 2.1.8 不同组织提取液包被对于嗜水气单胞菌生物膜形成的影响
• 2.1.9 数据处理
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 培养时间对嗜水气单胞菌成膜的影响
• 2.2.2 初始菌液浓度对嗜水气单胞菌成膜的影响
• 2.2.3 培养温度对嗜水气单胞菌成膜的影响
• 2.2.4 不同初始pH 值对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响
• 2+、Mg²⁺浓度对于嗜水气单胞菌生物膜形成的影响'>2.2.5 不同Ca²⁺、Mg²⁺浓度对于嗜水气单胞菌生物膜形成的影响
• 2.2.6 鳗鲡不同组织提取液对嗜水气单胞菌成膜的影响
• 2.3 讨论
• 第3章 嗜水气单胞菌成膜缺陷突变株构建、筛选与鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验用菌
• 3.1.2 主要实验仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 细菌结合转化构建嗜水气单胞菌突变体库
• 3.2.2 嗜水气单胞菌的成膜缺陷菌株的筛选
• 3.2.3 转座突变菌株的PCR鉴定和Southern杂交鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 质粒pLOF/Km的提取及转化E.coli Sm10
• 3.3.2 成膜缺陷突变株的筛选结果
• 3.3.3 突变株的PCR 鉴定
• 3.3.4 突变株的Southern鉴定
• 3.4 讨论
• 第4章 突变株中mini-Tn10插入位点侧翼序列分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 试验用菌和载体
• 4.1.2 主要实验仪器
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 基因组DNA 的抽取
• 4.2.2 热不对称PCR 法克隆转座子插入位点侧翼序列
• 4.2.3 PCR 产物回收、连接、转化和测序
• 4.2.4 序列分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 基因组DNA 提取的结果
• 4.3.2 Actail-PCR结果
• 4.3.3 Tail-PCR结果
• 4.3.4 基因序列分析结果
• 4.4 讨论
• 第5章 嗜水气单胞菌成膜缺陷突变株生物学特性研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 试验用菌
• 5.1.2 主要实验仪器
• 5.1.3 主要试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 生长曲线的测定
• 5.2.2 对鳗鲡肠粘液粘附实验
• 5.2.3 胞内存活能力测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 生长曲线
• 5.3.2 对鳗鲡肠粘液的粘附作用
• 5.3.3 在鳗鲡外周血巨噬细胞内存活能力
• 5.4 讨论
• 第6章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文