论文摘要
Bt cry1Ah基因是本实验室从国内苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）分离株BT8中克隆的新型杀虫蛋白基因,其编码蛋白对鳞翅目害虫具有强毒力,尤其对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis ）的毒力强于目前转基因作物研究中使用的cry1A类基因。利用cry1Ah基因进行抗虫转基因玉米研发在提高转基因玉米抗虫性的同时可以降低害虫抗性风险,获得的转基因玉米具有很好的应用前景。为了在玉米内验证cry1Ah的功能,本研究首先利用cry1Ah基因构建了植物表达载体pHUAh,该载体以潮霉素磷酸转移酶基因（hygromycin phosphotransferase,hyg）为筛选标记基因。用基因枪法转化玉米Q31（齐31）和Z31（综31）杂交组合的胚性愈伤组织,得到66株T0代转化植株,分子检测确定13株为阳性转基因玉米植株。通过对T1代植株进行田间抗虫性检测,筛选得到两个抗性转基因事件B1和B7。对B1和B7的T1-T5代转基因植株进行了四年跟踪检测,结果表明cry1Ah基因在玉米植株中可以稳定表达,并且可以逐代稳定遗传。转化cry1Ah基因的玉米对玉米螟具有较好的抗性,该基因可继续用于转基因抗虫玉米的研发。随后,我们利用cry1Ah基因构建了一个无筛选标记基因的植物重组表达载体pUAh,利用花粉管通道法转化玉米自交系X090。对获得的2200株T1代转化植株的Bt Cry1Ah蛋白表达进行检测,有172株为阳性植株。通过田间抗虫性测定,筛选到35株抗性植株。对其T2代植株进行抗虫性测定后确定了12个高抗转基因事件。随后分别从DNA水平、蛋白水平及田间抗虫性三方面对这12个高抗转基因事件的T2-T5代转基因植株进行了跟踪检测:DNA水平分析发现cry1Ah在转基因玉米中具有很好的遗传稳定性,T5代有9个转基因事件已经纯合,PCR阳性率为100%。蛋白水平的分析结果表明该基因在每代都可以正常稳定表达,但Cry1Ah蛋白在不同转化事件之间及同一转化事件不同组织部位内的表达量存在差异:转化事件P12（P12-8-7-13行）的Cry1Ah平均表达量最高,占可溶性总蛋白的0.130%。转化事件P16（P16-16-6-5行）的Cry1Ah平均表达量最低,占可溶性总蛋白的0.023%。对P12不同组织部位的Bt蛋白表达量的检测结果表明,Cry1Ah在苞叶中的表达量最高,占可溶性总蛋白的0.186%。抗虫性研究结果表明转cry1Ah基因玉米对亚洲玉米螟具有显著抗性,抗性可以逐代稳定遗传,并且抗性与蛋白的表达水平呈正相关。此外,本研究利用TAIL-PCR技术对花粉管通道法获得的转cry1Ah抗虫玉米P19的外源基因整合位点3′侧翼序列进行了初步研究,对得到的3′侧翼序列进行序列比对后发现其与玉米基因组4号染色体上的一段序列同源性最高,核苷酸一致性为99.5%。在玉米基因组内的具体位置为BIN4.09,初步确定了外源基因在玉米基因组中的整合位点。本研究获得的无筛选标记的遗传稳定的转基因玉米有很好的应用价值,可以作为候选材料进行下一步Bt抗虫玉米的育种工作。