论文摘要
肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,中国约占全球新增和死亡病例的50%,广西是全国肝癌高发区之一。肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是原发性肝癌最常见的组织学类型,其发生发展是一个多基因、多因素参与的复杂过程。核转录因子Sp3是Sp （Specificity protein）家族成员之一,在不成熟哺乳动物细胞中广泛表达,几乎参与所有细胞功能,包括细胞增殖、凋亡、分化等。目前发现许多肿瘤都存在Sp3高表达,并且在不同肿瘤中的作用机制不一致,在肝癌中的作用尚未明确。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活参与HCC的发生发展,而β-catenin是该信号通路中的关键作用分子,不仅在E-钙粘蛋白（E-cadherin）介导的细胞黏附、细胞骨架分化中起重要作用,而且能够在Wnt/β-catenin信号传导通道的关键环节调控cyclin D1及c-myc等原癌基因的表达。我们及其他实验室对肝癌中β-catenin检测发现它存在着过表达或突变,从而推测其的异常表达参与HCC的发生发展。目前,国内外尚无Sp3在肝癌中的表达及Sp3和β-catenin关系的研究。本课题从细胞、动物和组织水平上探讨Sp3在肝细胞癌中的作用及其与β-catenin的关系：利用细胞和分子生物学技术,通过RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术沉默人肝癌细胞HepG2中Sp3的表达,研究Sp3基因在体外环境中对人肝癌细胞生物学行为的影响及其机制；通过建立裸鼠人肝癌种植瘤模型,在体内进一步验证Sp3对人肝癌细胞生物学行为的影响；收集肝细胞癌及其癌旁组织,采用免疫组织化学法及RT-PCR法检测上述组织中Sp3、β-catenin的表达,探讨两者与临床病理资料的关系并进行生存分析；最后从细胞、动物和组织三个层面初步探讨Sp3和β-catenin的关系。研究内容包括以下三部分：第一部分RNAi沉默Sp3基因对人肝癌细胞HepG2生物学行为的影响目的：采用Sp3-shRNA慢病毒载体转染人肝癌细胞HepG2,观察沉默Sp3基因在体外对人肝癌细胞生物学行为的影响,并探讨其机制。方法：使用Sp3-shRNA慢病毒载体及空载质粒病毒载体转染人肝癌细胞HepG2,并建立稳定转染细胞株分别命名为实验组（Lv-shRNA-Sp3）和阴性对照组（Lv-shRNA-NC）。通过荧光定量PCR、Western blot及免疫荧光染色检测实验组（Lv-shRNA-Sp3）、阴性对照组（Lv-shRNA-NC）和空白组（HepG2）中Sp3的表达情况,以验证沉默效果。通过MTT检测细胞增殖,流式细胞技术测定各组的细胞周期及凋亡,透射电镜观察三组细胞的形态学改变,体外迁移及侵袭实验观察细胞运动能力。应用荧光定量PCR检测三组细胞中caspase-3和caspase-9mRNA的表达量,同时采用Western blot检测各组中pro-caspase-3和pro-caspase-9蛋白的表达情况,探讨凋亡机制。结果：1、荧光定量PCR、Western blot及免疫荧光染色结果均显示,实验组细胞Sp3mRNA和蛋白的表达明显低于其他两组（P＜0.05）;2、MTT结果显示,实验组细胞生长速度明显低于其他两组（P=0.005）；流式细胞仪结果显示,实验组细胞周期出现G1期阻滞（F=18.946,P=0.003）,凋亡率增加（F=53.647,P=0.000）；透射电镜在实验组中观察到典型的细胞凋亡形态；Trans well实验结果显示,实验组细胞的迁移和侵袭能力明显减弱（F=92.912, P=0.000; F=45.282, P=0.000）;3、实验组Caspase-3mRNA、Caspase-9mRNA表达明显高于阴性对照组和空白组（F=19.297, P=0.002; F=34.016, P=0.001）；实验组Pro-Caspase-3、Pro-Caspase-9蛋白表达明显低于阴性对照组和空白组（F=5.409, P=0.045; F=5.798, P=0.005）。结论：1、成功构建并筛选稳定沉默Sp3表达的实验组（Lv-shRNA-Sp3）和空载体阴性对照组（Lv-shRNA-NC）两株人肝癌细胞HepG2细胞株。2、Sp3基因在体外参与人肝细胞癌HepG2细胞的生物学行为调控：沉默Sp3基因可抑制人肝癌细胞HepG2生长,诱导癌细胞凋亡,减弱其迁移和侵袭能力。Sp3基因在肝细胞癌发生发展中扮演促癌作用。3、Sp3基因沉默后细胞凋亡率增加与caspase-3和caspase-9活化有关。第二部分RNAi沉默Sp3基因对裸鼠人肝癌种植瘤的影响目的：建立三组裸鼠人肝癌种植瘤模型,观察沉默Sp3基因对裸鼠人肝癌种植瘤的影响,并探讨其机制。方法：建立三组裸鼠人肝癌种植瘤模型,观察裸鼠肿瘤的成瘤率和生长速度；观察各组种植瘤的病理学改变；并应用荧光定量PCR、Western blot及免疫组织化学法检测各组种植瘤组织中Sp3的表达；应用TUNEL法检测各组种植瘤组织中肿瘤细胞的凋亡情况。结果：1、实验组的成瘤率明显低于其他两组（60%vs100%,100%）;与空白组和阴性对照组比较,实验组的种植瘤生长速度减慢（P<0.05）,4周后瘤体体积为（189.02±36.7）mm3,明显小于空白组及对照组（F=8.728,P=0.005）。2、实验组肿瘤细胞侵袭能力明显降低。3、实验组种植瘤中的Sp3mRNA和蛋白表达明显低于空白组及空载体阴性对照组（F=5.765,P=0.04; F=7.387,P=0.006）。4.TUNEL检测三组种植瘤组织中癌细胞的凋亡率：实验组明显高于空白组和阴性对照组（F=27.297,P=0.001）。结论：1、成功建立裸鼠人肝癌种植瘤模型。Sp3基因稳定沉默在体内保持稳定。2、Sp3基因在体内也参与人肝癌细胞生物学行为的调控,在肝细胞癌发生发展中扮演促癌作用。第三部分Sp3与β-catenin在肝细胞癌中的表达及关系目的：检测肝细胞癌组织和相应癌旁组织中Sp3及β-catenin蛋白和mRNA的表达,分析两者与临床病理资料的关系,并进行单因素和多因素分析。从细胞、裸鼠种植瘤模型和人肝细胞癌组织中初步研究两者的关系。方法：1、收集肝细胞癌患者手术标本83例,相应癌旁组织作为对照,运用免疫组织化学法检测肝细胞癌组织及癌旁组织中Sp3与β-catenin蛋白的表达水平,分析二者和临床病理资料的关系并进行生存分析。选取其中43例采用RT-PCR检测肝细胞癌组织及癌旁组织中Sp3与β-catenin mRNA的表达水平,并对二者和临床病理资料的关系进行分析。2、采用荧光定量PCR、Western blot、免疫组织化学法检测三组细胞、种植瘤和人肝细胞癌组织中Sp3与β-catenin的表达,初步分析Sp3与β-catenin的关系。结果：1、免疫组化检测结果显示,83例肝细胞癌组织中Sp3蛋白的阳性率显著高于癌旁组织（x2=47.731,P=0.000）,差异有统计学意义,伴有肝硬化改变的癌旁组织中Sp3蛋白阳性率明显高于无肝硬化改变组（x2=4.218,P=0.037）,差异有统计学意义。2、免疫组化检测结果显示,83例肝细胞癌组织中β-catenin蛋白的阳性率显著高于癌旁组织（x2=54.229,P=0.000）,差异有统计学意义。3、癌组织中Sp3蛋白的表达与肿瘤大小（x2=12.261,P=0.000）,组织学分级（x2=6.363,P=0.010）有关,与患者性别、年龄、有无脉管侵犯／转移组、有无子灶、是否伴有肝硬化、血清AFP水平、有无HBV感染无关（P＞0.05）。4、β-catenin蛋白的表达与肿瘤大小（x2=7.525,P=0.005）、组织学分级（x2=11.270,P=0.001）和有无脉管侵犯／转移（x2=4.910,P=0.028）有关,与患者性别、年龄、有无子灶、是否伴有肝硬化、血清AFP水平、有无HBV感染无关（P＞0.05）。5、RT-PCR对83例中49例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织进行检测,结果显示：癌组织中SpmRNA的表达水平明显高于癌旁组织（t=6.118,P=0.000）,差异有统计学意义。6、RT-PCR对83例中49例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织进行检测,结果显示：癌组织中β-catenin mRNA的表达水平明显高于癌旁组织及正常肝组织（t=7.027,P=0.000）,差异有统计学意义。7、癌组织中Sp3mRNA的表达与肿瘤大小（t=-2.549,P=0.015）、组织学分级（t=-4.238,P=0.000）有关,与患者性别、年龄、有无脉管侵犯／转移、有无子灶、是否伴有肝硬化、血清AFP水平、有无HBV感染无明显关系（P＞0.05）。8、癌组织中β-catenin mRNA的表达与肿瘤大小（t=-2.941,P=0.005）、组织学分级（t=-3.512,P=0.001）有关,与患者性别、年龄、有无脉管侵犯／转移、有无子灶、是否伴有肝硬化、血清AFP水平、有无HBV感染无明显关系（P＞0.05）。9、患者3年累计生存率为45.8%。10、单因素分析结果显示,肝细胞癌细胞中Sp3蛋白高表达组3年生存率明显低于低表达组（P=0.010）;肝细胞癌细胞中β-catenin蛋白高表达组3年生存率明显低于低表达组（P=0.001）。11、多因素分析结果显示,Sp3和β-catenin高表达均为肝细胞癌独立预后因子（HR=2.586,P=0,006; HR=2.289,P=0.009）。12、经Spearman等级相关分析,癌组织中Sp3和β-catenin蛋白表达呈正相关（r=0.298,P=0.006）。13、经Spearman等级相关分析,癌组织中Sp3和β-catenin mRNA表达呈正相关（r=0.835,P=0.000）。14、三组细胞中,实验组的Sp3、β-catenin mRNA表达均明显低于空白组及对照组（F=4.570,P=0.000;F=18.089,P=0.003）; Sp3、β-catenin蛋白表达均明显低于空白组及对照组（F=5.409,P=0.045: F=9.925,P=0.005）,15、三组种植瘤中,实验组的Sp3、β-Catenin mRNA的表达均明显低于空白组及对照组（F=5.765,P=0.04:F=17.246,P=0.003）;实验组的Sp3、β-catenin蛋白表达均明显低于空白组及对照组（P＜0.05）。结论：1、Sp3与β-catenin在肝细胞癌组织中均高表达。两者的高表达与肿瘤高增殖活性、组织低分化有关,提示Sp3和β-catenin在肝细胞癌发生发展中起重要作用。2、Sp3和β-catenin高表达均为肝细胞癌独立预后因子。3、Sp3和β-catenin的表达在肝细胞癌组织中呈正相关。4、沉默Sp3基因可下调β-catenin在人肝细胞癌HepG2细胞株以及种植瘤瘤体中的表达。
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