蚯蚓提取物镇痛有效成分分离纯化及镇痛作用的研究

论文摘要

本文为了探索蚯蚓提取物中的镇痛有效成分,对蚯蚓体内镇痛活性物质进行了分离纯化,研究其镇痛活性和作用,研究方法和结果如下：一.分离纯化：利用30%硫酸铵沉淀法对蚯蚓组织匀浆进行蛋白分离,分离产物利用27mm（MD34）透析袋（MW：12000-14000）进行透析。采用CM Sephadex C-50阳离子交换层析从蚯蚓蛋白粗提物中分离纯化出5个波峰,并采用Bulbring法筛选出其中两种可能具有镇痛活性的组分,分别为ACAE-C和ACAE-D;再利用Sephadex G-75凝胶过滤层析进一步分离纯化得到4个波峰,分别为ACAE-C1、ACAE-C2、ACAE-D1、ACAE-D2。利用SDS-PAGE样品凝胶,在Biosens SC805凝胶成像系统上成像,以Marker为对照,通过系统软件计算样品分子量,ACAE-C1分子量大约为28.3kD, ACAE-D1分子量约为26.4～32.3kD之间,ACAE-D2分子量约为26.0～31.8kD之间。二.镇痛成分的作用研究：1.小鼠热板法,测定了经Bulbring法筛选出的2个镇痛活性组分的镇痛作用。实验发现,ACAE-C和ACAE-D能够有效的提高痛阈,延长小鼠发生舔足反应的时间2.醋酸扭体法,实验发现,ACAE-C和ACAE-D能够有效的提高痛阈,减少小鼠因疼痛引起的扭体反应,并发现,蚯蚓提取物对痛阈的影响强度与剂量成正比,给药60min后,镇痛效果最佳,从而进一步证实了ACAE-C和ACAE-D的镇痛效果。3.Bulbring法,制备大鼠膈肌-膈神经离体模型,分别刺激膈神经和膈肌,筛选具有镇痛活性组分,并研究其作用靶点。实验发现,ACAE-C1组分对电刺激膈神经引起的肌肉收缩具有一定的抑制作用,对电刺激膈肌引起的肌肉收缩现象没有影响,其对电刺激神经引起的肌肉收缩的抑制作用抑制率可以达到50%-55%。三.动物实验采用经硫酸铵沉淀法制备的蚯蚓蛋白粗提物对小鼠Ⅱ度烫伤模型进行治疗,发现通过创面涂抹进行了5倍稀释或10倍稀释的蚯蚓蛋白粗提物,可以有效增加烫伤愈合面积,提高烫伤愈合率,加快结痂和痂皮脱离速度。通过免疫组织化学染色诊断发现,在烫伤初期蚯蚓蛋白粗提物可以加速肉芽组织对创面的充填,烫伤中后期可以加速血管细胞再生和减少炎性细胞的浸润。本实验首先通过CM Sephadex C-50阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析,从蚯蚓蛋白组分中分离纯化到一种具有镇痛活性较强的物质的ACAE-C1,该组分是一种小分子蛋白质,分子量约为28.3kD；其次研究了各级纯化产物对动物镇痛作用的影响,发现ACAE-C和ACAE-D具有镇痛活性；再次利用蚯蚓蛋白组分对小鼠Ⅱ度烫伤进行治疗,发现该组分具有加速创面愈合,减少炎性产物渗出的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 蚯蚓有效成分分离纯化及作用的研究进展
• 1.1 蚯蚓抗菌肽
• 1.2 蚯蚓纤溶酶相关成分的分离纯化及作用
• 1.3 蚯蚓抗氧化系成分的分离纯化及作用
• 2 动物源性镇痛物质分离纯化的研究进展
• 2.1 蝎毒镇痛活性物质分离纯化及作用
• 2.2 蛇毒镇痛活性物质分离纯化及作用
• 2.3 蜘蛛镇痛活性物质分离纯化及作用
• 2.4 蚯蚓镇痛抗损伤有效物质的分离纯化及作用
• 3 研究目的及意义
• 第二章 蚯蚓镇痛活性物质的分离纯化
• 1 材料
• 1.1 试验样品与动物
• 1.2 主要的试剂及仪器
• 2 方法
• 2.1 蚯蚓蛋白组分粗提
• 2.2 CM Sephadex C-50阳离子交换层析
• 2.3 膈神经-膈肌模型筛选活性组分
• 2.4 Sephadex G-75凝胶过滤层析
• 2.5 凝胶过滤层析产物对离体神经性兴奋性的影响
• 2.6 分子量测定
• 2.7 数据处理
• 3 结果
• 3.1 蚯蚓粗提物的制备
• 3.2 蚯蚓提取物CM Sephadex C-50阳离子交换层析色谱
• 3.3 活性组分筛选（Bulbring法制备大鼠膈肌-膈神经模型）
• 3.4 蚯蚓提取物Sephadex G-75凝胶过滤层析
• 3.5 蚯蚓镇痛活性成分对离体神经性兴奋性的影响
• 3.6 分子量的测定
• 4 讨论与分析
• 4.1 蚯蚓蛋白组分的粗提工艺优化和材料筛选
• 4.2 CM Sephadex C-50阳离子交换层析的材料选择和工艺优化
• 4.3 Sephadex G-75凝胶过滤层析的材料选择及工艺优化
• 4.4 蚯蚓镇痛活性成分对离体神经性兴奋性的影响
• 4.5 蚯蚓镇痛活性分离纯化技术的改良方向
• 4.6 分离纯化工艺小结
• 第三章 蚯蚓镇痛活性物质的作用研究
• 1 材料
• 1.1 试验样品与动物
• 1.2 主要的试剂及仪器
• 2 方法
• 2.1 镇痛粗提产物对小鼠烫伤的影响
• 2.2 阳离子交换层析产物镇痛作用的测试
• 3 结果
• 3.1 镇痛提取物对小鼠烫伤的影响
• 3.2 阳离子交换层析产物的镇痛作用
• 4 讨论与分析
• 4.1 镇痛提取物对小鼠烫伤的治疗作用
• 4.2 镇痛活性的功用
• 5. 小结
• 全文小结
• 参考文献
• 中英文缩词表
• 致谢
• 个人简介