稻瘟病菌激发子诱导烟草过敏性细胞死亡的功能域研究及互作蛋白筛选

论文摘要

稻瘟病是由Magnaporthe oryzae侵染引起的水稻主要病害,是全世界水稻生产上最重要的病害之一。该病害严重发生时引起的产量损失高达80%,甚至颗粒无收,严重威胁粮食生产安全。有效控制该病害的一个前提是了解水稻与稻瘟病菌互作分子机制。而稻瘟病菌外泌蛋白激发子的筛选以及其功能的阐述有助于揭示稻瘟菌激发子与植物互作分子机制。病原菌分泌的激发子在诱导植物产生防卫反应时,是一类重要的信号分子,与植物细胞中特异高度亲和的蛋白质受体结合,诱发植物一系列防卫反应。本实验室前期工作中,从稻瘟病菌效应因子组中筛选到的2个能够在烟草上引发HR的效应分子partl5248与part24474,本文对这2个激发子诱发细胞死亡的功能域进行分析。首先,为明确激发子的分子结构与诱导HR的相关性,将激发子的氨基酸组成进行缺失突变,通过PVX载体的病毒系统注射本氏烟草,发现partl5248N端缺失突变不能引起本氏烟草的细胞坏死,进一步找到了partl5248关键作用氨基酸,即第20位氨基酸和第25位氨基酸。当分别缺失这两个氨基酸时,都不能在烟草叶片上产生HR。其次,通过实时定量PCR,检测了这些突变体在烟草中的3种信号分子ET, JA、SA介导的抗病途径中效应基因转录水平的变化,发现partl5248诱导JA信号途径相关基因表达、参与植物抗性产生；野生型Apartl524820突变体（不能引起HR）诱导SA信号通路相关基因的表达。另外以2个激发子为诱饵蛋白,在本氏烟草cDNA文库中筛选到一个Nicotiana tabacum叶绿体铁氧化还原酶（Fdn-1）的片段,与Nicotiana tabacum叶绿体铁氧化还原酶的同源性高达94%,此铁氧还原蛋白被证明与活性氧和过敏性反应相关联。另外筛选到一个编码烟草的NTH201的基因,NTH201是一个KNOTTED1-like转录因子蛋白家族成员,与Nicotiana tabacum的NTH201同源性为95%,是与病毒侵染扩散相关的基因,其在细胞的胞间连丝处与运动蛋白（MP）共同作用,具有转录因子的作用。稻瘟病菌分泌的蛋白分子partl5248和part24474能诱导本氏烟草细胞死亡,在稻瘟病菌中分别敲除和过表达这两个基因,致病性试验中partl5248和part24474敲除致病性与稻瘟病菌野生型Guy11相比没有差异,partl5248过表达突变体对水稻的致病性与野生型相比有一定的降低,而part24474过表达突变体致病性与野生型相比没有差异。综上所述,partl5248不仅在非寄主植物中诱导防卫反应的产生,在参与病菌致病过程,其过表达突变体降低了稻瘟致病性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 诱导植物抗病性的激发子
• 1.1 真菌细胞壁的多糖成分
• 1.2 真菌表面的脂类化合物
• 1.3 真菌或细菌分泌的多肽、蛋白质、多糖等
• 1.3.1 激发素（elicitins）
• 1.3.2 糖蛋白（Glycoprotein）
• 1.3.3 分泌蛋白（Glycoprotein）
• 1.4 寡糖类激发子
• 2 激发子与植物防卫反应
• 2.1 激发子的植物受体与作用机理
• 2.2 激发子诱导的信号识别与传导
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 第一章 稻瘟病菌激发子诱导烟草过敏性死亡的功能域研究及互作蛋白筛选
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试烟草及供试稻瘟菌株
• 1.1.2 重组的马铃薯X病毒载体pgR107
• 1.1.3 大肠杆菌菌株JM109和农杆菌菌株GV3101
• 1.1.4 酵母菌株与培养条件
• 1.2 方法
• 1.2.1 稻瘟病菌DNA提取
• 1.2.2 RNA提取
• 1.2.3 RT-PCR克隆基因
• 1.2.4 稻瘟病菌和水稻互作不同时期RNA提取及分子孢子的RNA提取
• 1.2.5 激发子缺失突变体的基因克隆及PVX载体构建
• 1.2.6 农杆菌GV3101感受态细胞的制备及转化
• 1.2.7 激发子的CDS序列的多态性分析
• 1.2.8 诱导烟草细胞HCD的激发子突变分析
• 1.2.9 烟草防卫相关基因实时定量分析
• 5248与part2₄474酵母双杂交载体构建'>1.2.10 part1₅248与part2₄474酵母双杂交载体构建
• 1.2.11 酵母双杂交筛选互作蛋白
• 1.2.12 本氏烟叶片cDNA文库构建
• 2 结果
• 5248、part2₄474基因在分生孢子及植物侵染阶段表达'>2.1 激发子part1₅248、part2₄474基因在分生孢子及植物侵染阶段表达
• 5248与part2₄474在稻瘟病菌不同菌株间的多态分析'>2.2 激发子part1₅248与part2₄474在稻瘟病菌不同菌株间的多态分析
• 2.3 诱导烟草细胞HCD的激发子突变分析
• 2.3.1 诱导烟草细胞HCD的激发子片段缺失突变分析
• 2.3.2 诱导烟草细胞HCD的激发子定点缺失突变分析
• 5248与part2₄474激发子诱导的PR基因表达'>2.4 激发子part1₅248与part2₄474激发子诱导的PR基因表达
• 5248与part2₄474互作蛋白的筛选'>2.5 激发子part1₅248与part2₄474互作蛋白的筛选
• 2.5.1 cDNA文库构建
• 2.5.2 酵母双杂交文库筛选互作基因
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 稻瘟病菌激发子在稻瘟病菌中致病性分析
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株及培养条件
• 1.2 稻瘟病菌DNA、RNA提取和cDNA合成
• 1.3 激发子基因敲除突变体的获得
• 1.3.1 敲除突变体的构建及原生质体转化
• 1.3.2 敲除突变体的筛选及验证
• 5248与part2₄474基因过表达突变体的获得'>1.4 part1₅248与part2₄474基因过表达突变体的获得
• 1.5 实时荧光定量PCR
• 1.6 敲除突变体、过表达突变体致病性分析
• 2 结果分析
• 5248与part2₄474基因的敲除及突变体的获得'>2.1 part1₅248与part2₄474基因的敲除及突变体的获得
• 5248与part2₄474基因敲除、过表达Real time PCR表达量分析'>2.2 part1₅248与part2₄474基因敲除、过表达Real time PCR表达量分析
• 5248与part2₄474基因敲除、过表达不参与稻瘟病菌的致病过程'>2.3 part1₅248与part2₄474基因敲除、过表达不参与稻瘟病菌的致病过程
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 硕士学位期间发表的研究论文
• 致谢