宣木瓜中三萜酸的提取分离及其体外抑菌特性研究

论文摘要

宣木瓜为药食两用果品，含有丰富的营养和多种生理活性物质，尤其是其所含的齐墩果酸和熊果酸（五环三萜酸，皂甙类物质）,具有显著的药理作用和生物活性。为了充分有效的利用宣木瓜资源，本研究对安徽宣城地区宣木瓜果实成分进行探讨，研究了宣木瓜中五环三萜酸皂甙类物质的提取、分离和纯化工艺，并在此基础上运用新型分离纯化技术，制得高纯度的齐墩果酸和熊果酸单体；另外，对齐墩果酸和熊果酸皂甙混合物的体外抑菌作用进行了研究，为宣木瓜的深加工及生理活性成分的综合利用提供了理论依据。本研究主要结果包括：1.宣木瓜果实成分研究结果表明，宣木瓜中化学成分包括水份、、总糖、有机酸、粗纤维、蛋白质、齐墩果酸、熊果酸和果胶物质，含量分别为85.031%、2.582%、2.924%、1.752%、1.264%、0.086%、0.040%、1.321%。2.建立了分析型HPLC对宣木瓜中齐墩果酸和熊果酸同时定性定量分析的方法，即：色谱条件为：色谱柱：Phenomenex C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相：V(乙腈)：V(纯净水)=95:5；柱温：25℃；流速：0.5mL/min；检测波长：210nm；进样量：5μL。3.采用超声波辅助提取法提取宣木瓜中五环三萜酸皂甙，正交结果得出最佳工艺组合为乙醇浓度85%，提取温度55℃，提取时间20min，液料比1：20。对提取物进行多次纯化，分析型HPLC进行测定，结果表明：正丁醇水饱和溶液萃取所得五环三萜酸纯度为41.41%，经大孔吸附树脂层析法纯化后五环三萜酸纯度为71.98%，在此基础上，采用反相硅胶柱法进行纯化，得到样品纯度为93.56%的三萜酸。另外，经同时测定宣木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量，计算得知二者比例为2.14～2.22:1，RSD值为1.39%。4.利用制备型HPLC对反相硅胶柱法所得五环三萜皂甙混合物进行处理，通过分段收集的方法对皂甙混合物中的齐墩果酸和熊果酸进行分离，经分析型HPLC检测，结果表明制备型HPLC分离皂甙混合物的方法可行，制备后分别得到97.50%的齐墩果酸和97.27%熊果酸单体。建立的制备型HPLC最优色谱条件为：流动相：色谱柱为pursuit XRs C18(250mm×212mm,5μm)；甲醇：水=80∶20（V:V）；体积流量：20mL/min；检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：2.0mL。5.宣木瓜中五环三萜酸的体外抑菌结果表明，五环三萜酸具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好；不同纯度的五环三萜酸对枯草芽孢杆菌均有抑制作用，且纯度越高抑菌效果越明显；经实验测定，反相硅胶柱法纯化后的宣木瓜五环三萜酸对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为6.25%，即1.56mg/mL。通过比较不同pH值条件下纯度为41.41%宣木瓜粗提物原液对枯草芽孢杆菌抑制效果的影响，结果发现：宣木瓜五环三萜酸在酸性条件下（pH3左右）抑菌效果最好；通过比较不同温度处理纯度为41.41%五环三萜酸宣木瓜粗提物原液对枯草芽孢杆菌抑菌效果的影响，结果表明：宣木瓜五环三萜酸的热稳定性相对较好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 宣木瓜研究进展
• 1.1.1 宣木瓜概况
• 1.1.2 宣木瓜的营养成分及药理作用
• 1.1.2.1 宣木瓜的营养成分
• 1.1.2.2 宣木瓜的药理作用
• 1.1.3 宣木瓜的主要价值
• 1.2 齐墩果酸的研究进展
• 1.2.1 齐墩果酸的理化性质
• 1.2.2 齐墩果酸的药理作用
• 1.3 熊果酸研究进展
• 1.3.1 熊果酸理化性质
• 1.3.2 熊果酸的药理作用
• 1.4 生物活性成分的提取及分离纯化方法
• 1.4.1 五环三萜酸提取技术
• 1.4.2 宣木瓜中五环三萜酸的纯化方法
• 1.4.3 高纯度目标物单体制备方法
• 1.5 生物活性成分的检测方法
• 1.5.1 紫外—可见吸收光谱分析法
• 1.5.2 高效毛细管电泳法
• 1.5.3 高效液相、气相色谱法
• 1.6 生物活性成分抑菌作用的研究现状
• 1.6.1 皂甙成分抑菌作用研究进展
• 1.6.2 抑菌作用的评价方法
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 原料及预处理
• 3.1.1 原料
• 3.1.2 原料预处理
• 3.1.3 试验菌株
• 3.2 仪器与试剂药品
• 3.2.1 试验仪器
• 3.2.2 试验药品试剂
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 宣木瓜基本成分测定
• 3.3.1.1 含水率的测定
• 3.3.1.2 总糖的测定
• 3.3.1.3 有机酸测定
• 3.3.1.4 粗纤维的测定
• 3.3.1.5 蛋白质的测定
• 3.3.1.6 齐墩果酸和熊果酸含量的测定
• 3.3.1.7 果胶含量的测定
• 3.3.2 宣木瓜中五环三萜酸的定性定量分析
• 3.3.2.1 宣木瓜五环三萜酸提取液的制备
• 3.3.2.2 五环三萜酸的 TLC 定性分析
• 3.3.2.3 分光光度法测五环三萜酸含量
• 3.3.2.4 分析型 HPLC 测定齐墩果酸和熊果酸含量
• 3.3.3 超声波辅助提取法提取宣木瓜中五环三萜酸及正交试验设计
• 3.3.4 宣木瓜中五环三萜酸纯化方法
• 3.3.4.1 正丁醇的水饱和溶液萃取
• 3.3.4.2 大孔吸附树脂初次纯化
• 3.3.4.3 反相硅胶柱层析二次纯化
• 3.3.5 制备型高效液相色谱法分离齐墩果酸和熊果酸单体
• 3.3.6 五环三萜酸体外抑菌试验
• 4 结果与分析
• 4.1 宣木瓜果实中的基本成分测定结果
• 4.2 宣木瓜五环三萜酸的定性定量检测
• 4.2.1 宣木瓜中五环三萜酸 TLC 定性分析结果
• 4.2.2 分光光度法测五环三萜酸含量
• 4.2.3 HPLC 同时测定宣木瓜中齐墩果酸和熊果酸结果分析
• 4.2.3.1 检测波长的选择
• 4.2.3.2 流速对色谱峰的影响
• 4.2.3.3 流动相的选择
• 4.2.3.4 方法学考察结果
• 4.2.4 宣木瓜中两种三萜酸比例的测定
• 4.3 宣木瓜中五环三萜酸的提取、纯化结果分析
• 4.3.1 超声波辅助提取法正交试验结果
• 4.3.2 五环三萜酸纯化结果分析
• 4.3.2.1 正丁醇水饱和溶液萃取
• 4.3.2.2 大孔树脂层析法纯化五环三萜酸
• 4.3.2.3 反相硅胶柱层析法纯化结果分析
• 4.4 制备型高效液相色谱分离宣木瓜中齐墩果酸和熊果酸单体研究
• 4.4.1 制备型高效液相色谱色谱分离图
• 4.4.2 组分纯度测定
• 4.4.3 制备型高效液相色谱条件的优化
• 4.4.3.1 流动相组成对分离条件的影响
• 4.4.3.2 流动相流量对分离情况的影响
• 4.4.3.3 最佳进样量的选择
• 4.5 宣木瓜中五环三萜酸体外抑菌特性研究
• 4.5.1 五环三萜酸粗提物对不同菌种抑菌效果的测定
• 4.5.2 不同纯化方法所得五环三萜酸对枯草芽孢杆菌抑菌效果的测定
• 4.5.3 最低抑菌浓度的测定
• 4.5.4 pH 值对五环三萜酸抑菌活性的影响
• 4.5.5 处理温度对五环三萜酸抑菌活性的影响
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 发表论文