河南地区慢性胃炎、消化性溃疡患者携带的幽门螺杆菌基因分型

论文摘要

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori）感染是一个全球性的卫生问题，也是目前人类发生率最高的慢性细菌感染之一，全球50％左右的人群感染过H．pylori。大量的研究表明，H．pylori是消化性溃疡及慢性胃炎的主要致病因子，与胃癌和胃黏膜相关淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue，MALT）淋巴瘤的发生也具有一定的关系。1994年，世界卫生组织国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，IARC）正式将H．pylori列为第一类生物致癌因子；美国疾病预防控制中心也已经将H．pylori感染性疾病列为新出现的传染病之一。但是，并非所有感染H．pylori的人都会发病，大约20-30％的感染者可终身携带H．pylori而不发生胃炎、消化性溃疡等H．pylori相关性疾病；50％以上的感染者仅有不同程度的慢性炎症；10-15％的感染者可发生消化性溃疡；只有极少数发生胃部恶性肿瘤。不同类型的H．pylori菌株感染以及不同宿主的遗传免疫学差异可能是导致不同疾病结局的根本原因。本研究拟从病原学的角度探索H．pylori基因型别与不同感染结局的之间的关系。有关H．pylori致病多样性的机制目前还不十分清楚，基于H．pylori表型特征的一致性和基因结构高度变异性的特点，本研究选取与H．pylori毒力高度相关的毒力岛基因作为研究对象，结合针对H．pylori基因组的随机扩增多态性DNA分析，探索H．pylori基因分型方法。对象与方法1．研究对象分组：以临床确诊的慢性胃炎（chronic gastritis，CG）患者为来源的H．pylori为慢性胃炎组；以临床确诊的消化性溃疡（gastric ulcer，GU）患者为来源的H．pylori为溃疡组；其他来源的为非慢性胃炎非溃疡组（no-patient of CG/GU，NP）。2．幽门螺杆菌的分离培养：胃镜下常规方法获取胃肠疾病患者胃黏膜组织块，研磨后涂抹接种于改良布氏培养基；或通过胃管采集住院病人的清晨空腹胃液，调整pH，离心取沉淀涂抹接种子上述培养基。37℃恒温培养箱微需氧环境培养5-7天，对可疑菌落进行菌落形态、革兰氏染色和生化鉴定，取阳性者传代增菌。3．幽门螺杆菌基因组RAPD分析：酚-氯仿法提取H．pylori基因组DNA，以5’-CCGCAGCCAA-3’为引物序列进行随机扩增，琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，BIO IMAGING成像系统紫外观察并照相。与标准分子量DNA相比较，估计出每个扩增片段的分子量，以所有片段分子量作为变量进行编码，有为1，无为0，记录全部菌株的检测结果，输入SPSS13.0软件进行聚类分析。4．幽门螺杆菌vacA、cagA、cage和cagT基因多态性分析：PCR扩增vacA、cagA、cagE和cagT基因片段，编码扩增结果，比较这些基因在CG、PU、NP组的分布情况，并进行聚类分析。5．综合分型：由于92株H．pylori中均扩增得到了vacA基因片段，在菌株之间不具有定性差别，对基因分型没有贡献，因此不作为综合分型的变量。基因组RAPD分析结果与cagA、cagE和cagT基因多态性分析结果综合为一个数据库，进行聚类分析，多检测方法、多基因性状联合对H．pylori分型。6．幽门螺杆菌VacA毒素活性检测：提取H．pylori空泡细胞毒素，提取物与96孔板中长成单层的Hela细胞在体积分数5％CO2，37℃条件下共同孵育24hrs，光学倒置显微镜观察结果并照相保存。结果1．基因组RAPD分析结果：92株H．pylori呈现出各自不同的RAPD基因指纹图谱，说明H．pylori的基因组变异度极高，RAPD指纹图可作为H．pylori的菌株标示。SPSS13.0软件聚类分析，可将全部H．pylori分为4个基因型别，此4个型别在慢性胃炎组、消化性溃疡组和非慢性胃炎非溃疡组的分布经统计学检验证实差异没有显著性（P=0.77）。2．vacA、cagA、cagE和cagT基因分析结果：PCR扩增vacA、cagA、cagE和cagT基因片段，全部菌株中均扩增出了vacA，菌株之间不存在有或无的定性差别；部分菌株缺失了cagA、cagE和cagT中的一个或几个，在菌株之间呈现出多态性。依据cagA、cagE和cagT检测结果，聚类分析可以将92株H．pylori分为2个型别，CG、PU、NP三组研究对象的基因型别构成差异不具有统计学意义（P=0.45）。3．综合分型结果：对RAPD分析结果与cagA、cagE和cagT检测结果进行综合聚类分析，全部菌株分为4个基因型别。经统计学检验，慢性胃炎、消化性溃疡、非慢性胃炎非溃疡组基因型构成不同（P=0.03），三者各有自己的优势基因型。4．VacA毒素活性检测结果：本次实验50％（46/92）的菌株表达了VacA活性，但是活性表达情况既没有在不同疾病组之间表现出差异（P=0.96），也没有在各基因型之间表现出差异（P=0.54）。结论本病例对照研究应用RAPD和PCR技术检测92株临床分离的幽门螺杆菌基因特点，通过统计学聚类分析将这些菌株区分为不同的型别，结论如下：1．92株H．pylori呈现出各自不同的基因组随机扩增多态性DNA指纹图谱，RAPD指纹图可作为区分不同H．pylori的菌株标示；但是RAPD单一分型方法不能将本次研究中分离得到的河南地区H．pylori有效分型。2．本研究获得的全部H．pylori均具有vacA基因；部分菌株缺失了cagA、cagE、cagT三者中的一个或者几个，在菌株间呈现出多态性。依据cagA、cagE、cagT检测结果进行聚类分析，不能对本研究中的H．pylori有效分型。3．依据RAPD与cagA、cagE、cagT检测结果进行综合分型，CG、PU、NP组的基因型别构成不同，H．pylori基因型与疾病类型有关。4．本研究中VacA活性表达情况与H．pylori基因型别的联系、与不同疾病结局的联系均不具有统计学意义，证实表型分型效率低，对H．pylori不能有效分型。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 论文部分：河南地区慢性胃炎、消化性溃疡患者携带的幽门螺杆菌基因分型
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附表和附图
• 参考文献
• 综述部分：幽门螺杆菌分型研究进展
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 致谢