丙型肝炎病毒非结构蛋白5B与细胞蛋白CINP相互作用影响细胞周期及其机制的研究

论文摘要

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）感染后通常在体内保持低水平复制,但却极易引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌,具体机制至今尚不是很清楚。已知细胞周期的紊乱是肿瘤细胞发生的关键环节,一些与肿瘤发生相关的病毒感染均可引起细胞周期的紊乱。HCV是单正链RNA病毒,其基因组可编码包括结构蛋白和非结构蛋白在内的至少10种病毒蛋白。其中NS5B是HCV编码的非结构蛋白之一,具有RNA依赖的RNA多聚酶活性,是HCV复制的关键酶。近来有报道称NS5B除直接参与HCV复制外,还可以通过与宿主因子的相互作用影响正常细胞功能,例如免疫反应及细胞周期等,从而引起病变发生。已有报道提示NS5B蛋白可影响细胞周期进展,但不同研究小组所观察到的现象不太一致,且详细机制还不是很清楚。为确认NS5B对细胞周期的影响,首先在肝癌细胞系HepG2中构建了可由四环素调控的NS5B稳定表达细胞株（HepG2 Tet-on NS5B）。经G418和hygromycin B共同筛选,最终得到低背景高诱导表达的细胞克隆。Dox （doxycycline）诱导后,NS5B可被标签抗体和内源性抗体同时检测到,提示细胞系构建成功。然后利用流式细胞术在该细胞系中检测NS5B对细胞周期的影响。结果显示,NS5B诱导表达后,S期细胞明显增多,提示NS5B可使细胞周期S期延长。为探讨NS5B影响细胞周期的分子机制,包括何种宿主蛋白参与该过程,应用酵母双杂交试验从肝细胞文库中筛选了可能与NS5B存在相互作用的细胞蛋白,发现细胞蛋白CINP （cyclin-dependent kinase 2 （CDK2）-interacting protein）为候选蛋白之一。鉴于CINP跟细胞周期相关,可以推测NS5B可能通过与CINP的相互作用影响了细胞周期。为了验证这一假设,利用GST pull-down和免疫共沉淀证实NS5B与CINP之间的相互作用,免疫荧光激光共聚焦试验也观察到两者在胞浆核周区域存在部分共定位。截短体试验进一步表明两者之间的相互作用,且发现CINP的C末端负责与NS5B相互作用,而NS5B的84-95及455464两段氨基酸负责与CINP相互作用。CINP最早是在HeLa细胞中以CDK2相互作用蛋白被发现,前期研究表明CINP可与染色体结合,参与DNA的合成。为了确认CINP是否具有对细胞周期的调控功能,用胸腺嘧啶核苷使HeLa细胞同步化于细胞周期的G1/S期,再转染CINP及相应空载体,流式检测细胞周期变化。结果发现空载体转染组可进入正常细胞周期,而CINP转染组细胞仍停滞在G1期。用小干扰RNA将内源性CINP干扰后,S期细胞显著增多。这些结果提示CINP确实存在对细胞周期的调控功能。接着将不能与CINP相互作用的NS5B截短突变体（ANS5B）与全长NS5B或相应空载体分别转入细胞,流式细胞术和CCK-8检测结果发现：与全长NS5B相比,ΔNS5B和空载体转染组细胞周期和细胞生长均不受影响,提示NS5B对细胞周期的影响依赖其与CINP的结合。为了进一步探讨NS5B与CINP相互作用之后影响细胞周期的分子机制,首先检测NS5B对CINP的蛋白表达是否有影响。结果发现不同情况下NS5B的表达对CINP的蛋白水平都没有明显改变。由于CINP是胞核蛋白,而NS5B主要定位于胞浆,先前的共聚焦结果显示两者可在核周区域部分共定位,提示NS5B可能使CINP发生了亚细胞定位的改变。激光共聚焦试验验证了这个假设：全长NS5B可使原本在核内的CINP重新定位于胞浆,而不与CINP结合的截短体△NS5B则不具备这个功能。同时,在HCV亚基因组复制子和细胞培养病毒JFH-1感染的Huh7.5细胞中也可观察到CINP定位的改变。除此之外,核浆分离的结果也发现CINP在NS5B表达的细胞中发生从核到浆的移位；将JFH-1感染后的Huh7.5细胞持续传代来模拟慢性感染过程,也得到类似的结果。DNA损伤反应（DNA damage response, DDR）是DNA损伤发生时调控细胞周期的重要信号通路。DNA损伤发生后,有三个细胞周期检查点可被激活：G1/S期阻止细胞进入S期；intra-S期抑制DNA合成；G2/M期防止损伤的DNA继续分裂。近期有报道显示CINP也可参与DNA损伤反应通路并具有维持基因组稳定性的作用,提示DDR可能介导了NS5B/CINP相互作用后细胞周期的紊乱。因为NS5B使CINP从核到浆的移位减少了核内发挥功能的CINP的量,用RNA干扰直接下调CINP后发现DDR通路中的可对S期进行调控的重要分子pRb、pChk1显著降低而p21则明显升高。与此相一致,NS5B诱导表达后pRb、pChk1也有明显下调且可被CINP的过表达所部分回复。这些结果提示NS5B可能通过与CINP相互作用影响了DDR通路进而对细胞周期产生影响。上述结果表明,HCV NS5B与CINP的相互作用可使CINP发生从胞核到胞浆的移位,从而影响了DDR通路,使细胞S期延长。这为深入了解HCV持续性感染和肿瘤发生的机制开辟了新的思路。

论文目录

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• 结果
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