树鼩IgG分离纯化与抗体制备

论文摘要

目前全球大约有1.7～2.0亿人感染丙型肝炎病毒（HCV）,约占全球总人口的3%。感染HCV后,大部分感染者转变为慢性感染,还有较大比例的病人最终发展成肝硬化甚至肝癌,这表明丙型肝炎已成为威胁人类健康的一个主要公共卫生问题。由于缺少合适的动物模型,严重阻碍了人们对HCV发病机理、治疗药物及相关疫苗的研究。黑猩猩是目前已证实的唯一对HCV易感的动物模型,但是其价格昂贵,且濒临灭绝,不易推广使用。因此,寻找经济实用的动物模型就成为目前丙型肝炎研究的当务之急。国内外许多研究学者发现树鼩——一种类似松鼠的小型哺乳动物具有成为HCV动物模型的潜力,但树鼩作为动物模型当前最大的困难就是没有合适的检测工具,即各种商业化的检测抗体,而制备多克隆或单克隆抗体的关键就是分离纯化出纯度较高的免疫球蛋白。本研究采用辛酸-硫酸铵沉淀并结合Sephacryl-S200凝胶过滤层析和DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析分离纯化树鼦血清免疫球蛋白G（IgG）。SDS-PAGE结果表明纯化的IgG纯度较高,同时测定了树鼦血清中IgG的分子量约为160kD,其重链分子量为53.5kD,轻链分子量为28.4kD。以提纯的免疫球蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备了兔抗树鼦IgG多克隆抗体,免疫双扩散法检测多克隆抗体效价达到1∶8,酶联免疫吸附（ELISA）检测效价达1∶25600;同时建立了检测抗体的间接ELISA法,实验的最佳反应条件:抗原包被浓度为1.2μg/ml,待测血清的最佳稀释度为1∶1000,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶8000。运用免疫印记法（Western-blotting）检测多克隆抗体的特异性,结果表明所制备的兔抗树鼩IgG抗体可以用于树鼩血清中抗原特异性IgG的检测,其能与树鼩血清中IgG的重链、轻链反应。以上结果表明我们获得了高效价、高特异性的兔抗树鼩IgG多克隆抗体。以纯化的IgG作为抗原,与等量弗氏完全佐剂（第一次）、弗氏不完全佐剂（第二次）混合后皮下及腹腔注射免疫6周龄BALB/c小鼠（100μg/只）,每次间隔2周。静脉加强免疫3天后,取免疫小鼠的脾细胞和对HAT敏感的骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合。本研究采用化学法融合,融合剂为分子量1500的聚乙二醇（PEG-1500）。融合过程在50ml灭菌离心管中进行,按5∶1的比例将脾细胞和骨髓瘤细胞置于离心管内,使之充分接触,按严格的剂量逐滴加入融合剂使细胞发生融合,然后加入HAT培养基,滴加到铺满饲养细胞（小鼠腹腔巨噬细胞）的96孔培养板内培养,第二天检查是否污染。当细胞长满培养板时,取细胞上清液,用间接EUSA进行阳性孔的筛选。我们对树鼩血清免疫球蛋白的纯化进行了探讨,得到了高纯度的树鼩IgG,并制备了兔抗树鼩多克隆抗体,同时对树鼩IgG单克隆抗体进行了初步制备,为树鼩在抗体方面的检测提供了有效的工具,并为HCV疫苗评价奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 丙型肝炎及其危害性
• 1.2 丙型肝炎疫苗的研究现状
• 1.2.1 重组亚单位疫苗与多肤疫苗
• 1.2.2 重组病毒载体疫苗
• 1.2.3 DNA疫苗
• 1.2.4 转基因植物疫苗
• 1.2.5 病毒样颗粒疫苗（VPL疫苗）
• 1.3 可能的丙型肝炎动物模型——树鼩
• 1.3.1 树鼦简介
• 1.3.2 树鼩动物模型
• 1.3.3 树鼦在丙型肝炎中的应用
• 1.4 免疫球蛋白及其制备技术
• 1.4.1 免疫球蛋白与抗体
• 1.4.2 免疫球蛋白的分子结构及分类
• 1.4.3 免疫球蛋白的制备技术
• 1.5 多克隆和单克隆抗体技术
• 1.5.1 抗体形成机理
• 1.5.2 影响抗体产生的因素
• 1.5.3 多克隆抗体的制备
• 1.5.4 单克隆抗体（Mono-clonal antibody，McAb）
• 1.6 本研究的意义和目的
• 1.7 研究路线图
• 第二章 树鼩血清免疫球蛋白的纯化与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 树鼦血清的制备
• 2.2.3 免疫球蛋白的分离、纯化
• 2.2.4 蛋白纯度测定
• 2.2.5 分子量的测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 树鼩血清免疫球蛋白Sephacryl-S200柱层析
• 2.3.2 DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析
• 2.3.3 蛋白含量测定
• 2.3.4 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.5 分子量的测定结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 分离策略的选择
• 2.4.2 蛋白质的检测
• 2.4.3 提纯蛋白的保存
• 第三章 兔抗树鼦血清免疫球蛋白G多克隆抗体的制备
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 免疫抗血清的制备
• 3.2.3 双相琼脂扩散检测多克隆抗体的效价
• 3.2.4 间接ELISA法检测多克隆抗体的效价
• 3.2.5 酶标记羊抗兔抗体最佳工作浓度的选择
• 3.2.6 抗原抗体最佳包被量的确定
• 3.2.7 多克隆抗体的制备及保存
• 3.2.8 免疫印迹试验（western-blotting）检测多克隆抗体的特异性
• 3.3 结果
• 3.3.1 双相琼脂扩散检测多克隆抗体的效价
• 3.3.2 间接ELISA法检测多克隆抗体的效价
• 3.3.3 酶标记羊抗兔抗体最佳工作浓度的选择
• 3.3.4 抗原抗体最佳包被量的确定
• 3.3.5 Western-blotting检测多克隆抗体的特异性
• 3.4 讨论
• 3.4.1 多克隆抗体
• 3.4.2 双相琼脂扩散
• 3.4.3 ELISA实验条件的优化
• 3.4.4 免疫印迹
• 第四章 单克隆抗体的初步制备
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 免疫BALB/c小鼠
• 4.2.3 SP2/0细胞的复苏与冻存
• 4.2.4 饲养细胞的制备
• 4.2.5 脾细胞的制备
• 4.2.6 细胞融合
• 4.2.7 杂交细胞的维护与增殖
• 4.2.8 杂交瘤的检测
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A