论文摘要
乙型肝炎（HB，type B hepatitis）是危害人类生命健康的一大顽疾之一。在中国，专家估计约有1.2亿人为乙型肝炎病毒（HBV，hepatitis b virus）携带者，其中乙肝患者有3000万。HBV感染能导致肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌而威胁人类生命。我国有着丰富的中药及海洋药物资源，从中找到一些新型高效的抗乙肝病毒药物来治疗乙肝和有效遏制乙肝的高流行状态，已经迫在眉睫。海鞘（Ascidian）是尾索动物亚门（Uronordata）海鞘纲的尾索动物。在自然界中已知有1500余种，主要分布在热带及亚热带海域。我国南海有丰富的海鞘资源，近年来对海鞘的化学成分及其生理活性的研究是海洋天然产物研究的热门领域，研究已发现海鞘类生物中含有生物碱类、肽类、吲哚类、重金属螯合剂、多硫化物、大环内酯、萜类等数十种化合物，且大部分都具有较强的生理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、诱导肌浆网释钙、抑制钙调蛋白活性等，其中有关抗肿瘤及抗病毒的研究报道较多。目前对海鞘的开发研究主要集中于抗肿瘤或抗病毒新化合物的分离筛选、合成及其结构改造，但对于海鞘抗乙型肝炎病毒的研究尚未见报道。本课题根据海鞘中有关生物碱和皂苷的报道，利用生物碱和皂苷的提取方案，获取了皱瘤海鞘中的生物总碱及皂苷部位，利用转染HBV的HepG2 2．2．15细胞作为体外药效学模型，对新鲜皱瘤海鞘[Styelaplicata（lesueur）]生物总碱及皂苷部位进行体外抗乙肝病毒试验，以考察其药效，并对已获得的皱瘤海鞘抗乙肝病毒有效部位群建立了高效液相（HPLC）指纹图谱，以便对其原料来源及其制剂进行质量控制。本课题可分为以下三个部分：1皱瘤海鞘有效部位的分离与鉴定我们采取生物总碱及皂苷的提取方案分别从新鲜的皱瘤海鞘中提取得到生物总碱部位及正丁醇部位。主要的分离过程是：取去内脏皱瘤海鞘，用95％乙醇（用H2SO4调节pH至3）浸泡24h，回流提取2小时，溶液过滤，滤液减压回收乙醇，水浴蒸干得浸膏，浸膏用1％H2SO4溶解，用等体积氯仿萃取除酯，余液用10％氨水调节pH值至9.5，碱水液用等体积氯仿萃取，氯仿层水浴蒸干，得生物总碱部位。从皱瘤海鞘醇提物中萃取得到正丁醇部位（S），利用硅胶柱层析技术对皱瘤海鞘正丁醇部位进行系统分离，用氯仿：甲醇不同比例依次洗脱得到Fr-S1，Fr-S2，Fr-S3和Fr-S4部位，由于Fr-S3有较强的抑制病毒的活性，且量较多，故从Fr-S3中纯化得到HQS3化合物。2皱瘤海鞘有效部位的体外药效学试验运用HepG2 2．2．15细胞体外药效筛选模型，对生物总碱部位及正丁醇各部位进行了药效筛选。通过药效学试验及MTT结果可知：生物总碱在体外能显著抑制HepG2 2．2．15细胞分泌HBsAg和HBeAg，其IC50分别是1.110mg／ml，1.715mg／ml，而且其对细胞基本没有毒性，安全性高。经实验表明，正丁醇部位（S）、Fr-S2、Fr-S3均有一定的抗乙肝病毒的效果，Fr-S3部位表现出较强的抑制HepG2 2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg的药理活性，故对该部分进一步采用硅胶柱层析分离，得到化合物HQS3，其在0.125mg／ml低浓度下也有较强的抑制细胞分泌HBsAg及HBeAg的药理活性。根据计算，HQS3抑制HBsAg的半数有效浓度为0.159mg／ml，抑制HBeAg的半数有效浓度为0.468mg／ml。该化合物在高浓度下表现出一定的毒性，但在所测浓度中，细胞破坏率未达到50％，故其半数毒性浓度TC50大于0.5mg／ml，其抑制HBsAg及HBeAg治疗指数TI分别为大于3.14和1.07。根据其治疗指数可以认为化合物对抑制2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg有一定效果，且细胞毒性不大，为开发抗新型高效低毒的乙肝药物提供了理论依据。3皱瘤海鞘抗乙肝病毒有效部位指纹图谱的研究本课题利用HPLC技术建立了皱瘤海鞘有效部位指纹图谱的分析方法。该方法是以从皱瘤海鞘中提取分离得到有效单体成分-多肽Sub（氨基酸序列为Ser-Ser-Leu-Ser-Lys-Ala-Ala）为基础，以皱瘤海鞘药材中抗乙肝有效部位作为质控对象，并利用现代仪器分析技术进行分析。试验采用线性梯度洗脱方式，该方法色谱条件容易控制，各个峰之间能够得到较好的分离，分析结果具有较好的试验精密度和试验重现性。在该色谱条件下，皱瘤海鞘有效部位的HPLC谱可以检出13个共有峰。色谱图中S峰即为Sub的色谱峰，即从皱瘤海鞘中提取分离得到的一种多肽单体成分。以S峰作为基准，其它各峰与之相对照，分别得到各峰的相对保留时间值和峰面积比值，可基本反映各个HPLC色谱峰间的关系。在10份皱瘤海鞘供试品溶液的HPLC图谱中，13个色谱峰的相对保留时间均比较稳定，各特征峰平均相对保留时间分别为0.95（1）、1.00（S）、1.21（3）、1.28（4）、1.54（5）、1.61（6）、1.71（7）、1.78（8）、1.85（9）、1.98（10）、2.05（11）、2.10（12）、2.28（13），相对偏差小于3％，可以确定为主要峰作为定性鉴别的指标参数。各共有峰的相对峰面积分别0.27（1）、1.00（S）、0.45（3）、0.98（4）、5.04（5）、1.78（6）、0.85（7）、0.44（8）、0.75（9）、0.76（10）、0.18（11）、0.17（12）、0.95（13），得到13个共有指纹峰，且共有指纹峰的面积和占总峰面积的90％以上，完全符合指纹图谱规范要求。该指纹图谱的建立，能对皱瘤海鞘原材料及其制剂进行质量控制。