论文摘要
肿瘤是一种非常复杂的疾病,是环境与遗传因素交互作用的结果,涉及到细胞内多个基因的突变和多条信号通路的改变,是一个多过程事件。对绝大多数肿瘤而言,从正常细胞发展到肿瘤细胞,需要多种重要生物学功能的获得,即:维持增殖信号、逃避生存抑制、对抗细胞凋亡、细胞无限增殖、持续的新血管生成、激活侵袭和转移、能量代谢的程序性重排和避免免疫损伤等。肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）是存在于肿瘤内的极少数细胞,这些细胞具有无限增殖、自我更新及多向分化的潜能。它们被认为是肿瘤的种子,是肿瘤无限增殖、复发和转移的根源。90%以上的肿瘤患者死于肿瘤转移。肿瘤转移过程由几个独立的步骤组成,包括肿瘤细胞从原发灶脱离,肿瘤细胞侵袭到血管内皮或淋巴管从而进入循环系统,最后,在新的宿主环境中,粘附并再侵袭,增殖成为一个转移瘤。肿瘤的新血管生成与肿瘤细胞增殖、侵袭转移、抗凋亡等生物学行为密切相关,肿瘤生长到1-2毫米时就需要有新血管长入提供生长所需的物质,否则会导致肿瘤细胞凋亡和/或坏死、休眠而不能生长。所以,对肿瘤的新血管生成和肿瘤转移机理的了解,为我们预防诊治肿瘤提供坚实理论依据。细胞凋亡是一个重要的对抗细胞过度增殖和细胞恶变的保护机制。细胞的存活与凋亡之间是平衡的,这种平衡功能失调会增加患肿瘤的风险。CASP8是Caspase家族在细胞凋亡过程中的关键成员,在两条凋亡途径及其交联中起着重要作用。因此,CASP8基因变异能扰乱CASP8功能,进而影响细胞凋亡的执行,有助于人类肿瘤的形成。前列腺癌是目前导致西方国家男性死亡的主要疾病之一,在我国前列腺癌发病率上升非常迅速。由于我国人口基数大,前列腺癌患病人数激增,必须重视前列腺癌的预防和治疗。前列腺癌是一种非常复杂的疾病,病因尚不完全清楚,可能与遗传、环境、性激素等多种因素有关。前列腺癌的传统治疗方法包括手术、内分泌治疗和放化疗,治疗效果并不十分理想。手术治疗后复发率比较高。一旦复发的前列腺癌转变为雄激素非依赖性,治疗将更加困难。因此,明确前列腺癌的发病机理,将有利于对前列腺癌的防治。目的:1.分析EGFR、HER2和前列腺癌的前列腺癌神经内分泌分化（neuroendocrine differentiation, NED）与前列腺癌的分期分级等相关性;并探讨外源性EGF通过与受体相结合后在调节NED和肿瘤转移过程的作用。2.揭示前列腺癌组织和细胞株内源性活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生水平,阐明前列腺癌细胞内源性ROS升高后诱导肿瘤血管生成和促进肿瘤形成的作用。3.研究凋亡通路CASP8的基因单核苷酸多态性与降低前列腺癌风险性之间的关系。方法:1.本研究用免疫组化方法检测前列腺癌组织样本EGFR、HER2和NSE的改变,并与患者的临床分期分级等指标相关联;并用分离出前列腺癌干细胞的DU-145细胞株,模拟临床肿瘤内浓度的EGF诱导,检测诱导前后NED和肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的改变,通过划痕、Transwell迁移和侵袭实验来研究EGFR和HER2的受体阻断剂对EGF诱导前列腺癌细胞发生NED和对肿瘤转移过程的影响。2.利用荧光探针法检测前列腺癌冰冻组织样本中前列腺癌上皮和正常上皮中ROS的表达水平差异,用产生ROS的NADPH酶的抑制剂DPI和H2O2的清除剂Catalase处理前列腺癌细胞株,证明前列腺细胞能自发产生高水平内源性ROS;抑制肿瘤细胞内源性ROS的产生,能抑制肿瘤细胞的增殖和血管生成;通过免疫组化检测CD31和Ki67在前列腺癌组织和正常组织中的表达,并与肿瘤组织中ROS相关联,明确ROS与肿瘤的新血管生成和肿瘤形成的关系。3.采用PCR-RFLP和基因探针分型方法研究凋亡通路中CASP8的基因多态性与前列腺癌患者发病风险的相关性研究,并在23例前列腺癌组织样本验证相关基因型的结论。结果:1.对54例前列腺癌患者组织样本的免疫组化检测发现,EGFR、HER2和NSE的蛋白表达在临床分期之间差异有统计学意义,晚期前列腺癌表达量高;以前列腺癌的Gleason分期、手术前PSA水平和患者年龄为分类标准进行相比,差异无统计学意义。肿瘤组织的NED与EGFR和HER2的表达成正相关,结果有统计学意义。与人前列腺癌肿瘤组织内相似浓度的EGF可以诱导DU-145发生NED,NED的标志性蛋白NSE改变在诱导后第二天改变最明显,诱导后第二天肿瘤细胞的迁移和侵袭能力明显增加;其增加的迁移和侵袭能力能被EGFR受体阻断剂抑制AG1478和HER2的受体阻断剂AG825抑制;阻断EGFR受体可明显抑制EGF诱导DU-145发生NED。2.对15例新鲜前列腺癌组织样本ROS的检测,发现前列腺癌上皮中ROS的表达量分别是正常腺上皮、PIN的2.4倍和72倍,随着肿瘤发生和进展,肿瘤细胞的内源性ROS的表达量明显增加。前列腺癌细胞株PC-3和DU-145产生高水平的内源性ROS,可以被NADPH酶的抑制剂DPI抑制和H2O2分解酶Catalase清除,抑制和清除内源性ROS的产生,是通过抑制P70S6K1和HIF-1α的表达,而抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤新的血管生成。免疫组化法检测26例前列腺癌组织中CD31和Ki67的表达,并与前列腺癌组织中的ROS相关联,发现ROS的表达水平与CD31和Ki67的表达成正相关,结果有统计学意义。3.我们确定了CASP8 -652 6N的ins/del多态性与前列腺癌的风险降低相关,6N的ins/del+del/del基因型与较低CASP8 mRNA表达水平相关。这是首次在中国人群中报道CASP8 -652 6N的ins/del多态性与前列腺癌风险的关系。结论:临床上EGFR和HER2的表达在前列腺癌的临床分期、分级中差异有统计学意义,分期分级越高,EGFR和HER2的表达越强;前列腺癌的NED与临床分期有关,分期越高,发生NED越多,并与EGFR和HER2的表达呈正相关;前列腺癌内相似浓度的EGF能促进DU-145发生NED和肿瘤细胞的迁移侵袭能力增加,EGFR和HER2受体阻断剂能明显抑制诱导后肿瘤细胞增加的迁移和侵袭能力,而阻断EGFR还可明显抑制DU-145诱导发生的NED。与前列腺癌旁的正常前列腺组织和PIN相比,前列腺癌组织中产生更高水平的内源性ROS,前列腺癌细胞产生的内源性ROS能促进肿瘤细胞的增殖和新血管形成,p70S6Kl和HIF-1是前列腺癌细胞产生的内源性ROS促进肿瘤细胞的增殖和新血管形成重要调节因子。确定了CASP8-652 6N的ins/del多态性与降低中国人前列腺癌患病的风险相关。