高SOD，低双乙酰啤酒酵母工程菌的构建

论文摘要

双乙酰是影响啤酒的主要风味物质之一,它在啤酒中的阈值很低,超过这一阈值就会产生一种酸馊味,因此其含量的高低是啤酒质量优劣的重要标志。啤酒在储存过程中会产生一种纸板味,这主要是因为啤酒中一些挥发性的长链不饱和醛类发酵时未充分还原所致,啤酒的氧化作用是其风味稳定性变差的最初来源。因此,如果将二者结合起来研究,势必会给改善啤酒风味的稳定性,防止啤酒老化,甚至是对饮用者的健康都会带来良好的效果。本研究选用啤酒酵母工业菌株青岛啤酒酵母菌株YSF31为材料,采用自克隆技术构建了一个新的啤酒酵母工程菌株,得到的新菌株同YSF31比较双乙酰含量有所降低,抗老化的能力增强。以青岛啤酒酵母菌株YSF31的总DNA为模板,PCR扩增出超氧化物歧化酶基因SOD1和α-信号肽基因。将PCR扩增得到的SOD1基因插入到质粒pYCUP（中科院微生物所酵母遗传育种实验室保存,以下简单称实验室,含有CUP1基因）的SphⅠ和SalⅠ位点得到一个中间质粒pMC2。再将PCR扩增得到的α-factor基因插入到质粒pMP1（实验室保存,含有3-磷酸甘油酸激酶基因PGK1）的EcoRI和SmaI位点上得到另外一个中间质粒pMC1。用BglⅡ和SphⅠ酶切质粒pMC2得到含有CUP1和SOD1的片段,再用KpnⅠ和SphⅠ酶切质粒pMC1得到含有PGK1和α-factor的片段,将上述两个基因片段插入到质粒pPILV4（实验室保存,含有ILV2基因）的KpnⅠ和BglⅡ位点,获得最终的重组质粒pMC572。采用同源重组的方法将用内切酶酶切质粒pMC572得到的含有SOD1,CUP1,PGK1和α-factor以及ILV2两端序列的片段转化啤酒酵母YSF31。研究结果如下:1.通过细胞对硫酸铜的抗性初步筛选到转化子,转化子对硫酸铜的抗性较受体菌有很大的提高。受体菌仅能在5mmol/L的浓度上生长,转化子能在8mmol/L的浓度上生长。2.用不同的引物组合进行PCR验证,发现转化子均能得到目的条带而受体菌什么也没有。3.通过乙酰乳酸合成酶（AHAS）活性测定,经验证转化子的AHAS酶活性仅为受体菌的一半,说明SOD1,CUP1,PGK1和α-factor片段已经整合到染色体上,ILV2的一条等位基因被破坏,转化子被命名为Z-2-8。4.啤酒酵母细胞内的SOD是不能自行分泌到胞外的,由于α-factot基因的整合使转化子胞内的SOD成功分泌到胞外,而受体菌的发酵液中一直都没有SOD的活性。同时,乙偶姻的含量也只有受体菌的50%,势必会最终导致双乙酰含量的降低。5.另外在CO2减重实验,生物量检测和其他发酵指标检测实验中发现新的啤酒酵母工业菌株同受体菌比较并没有发生显著的变化。由于本实验的DNA操作过程中并没有任何外源基因的介入,均来自啤酒酵母自身,因此该啤酒酵母菌株为生物安全的自克隆菌株,具有重要的实际运用价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 一 文献综述
• 1.关于双乙酰的研究
• 1.1 双乙酰及其合成
• 1.2 关于降低啤酒中双乙酰含量的策略
• 1.3 利用基因工程的方法降低啤酒发酵过程中的双乙酰
• 2 关于SOD的研究
• 2.1 SOD的分布及分类
• 2.2 SOD的检测方法
• 2.3 SOD的物理化学性质
• 2.4 SOD基因的克隆和表达
• 2.5 SOD的应用
• 3 酵母菌及其遗传修饰方法
• 3.1 实验室酵母菌和工业酵母菌
• 3.2 工业酵母菌的遗传修饰
• 4.酵母遗传修饰的筛选标记
• 4.1 营养缺陷标记
• 4.2 药物抗性标记
• 4.3 反向选择标记
• 4.4 颜色指示和rDNA重组反向选择技术
• 4.5 GALp-GIN11反向选择技术
• 4.6 铜离子络合蛋白基因作为筛选标记基因的应用
• 5 研究的目的和意义
• 二 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 培养基和培养条件
• 1.3 酶和试剂
• 1.4 缓冲液及试剂
• 2.方法
• 2.1 DNA操作
• 2.2 AHAS酶活测定
• 2.3 SOD酶活的测定
• 2.4 酵母凝聚性的测定
• 2.5 α—N的试验方法
• 三 结果与分析
• 1 重组质粒的构建
• 1.1 质粒pMC2的构建
• 1.2 质粒pMC1的构建
• 1.3 质粒pMC572的构建
• 2 工程菌的构建及检验
• 2.1 酵母菌的转化
• 2.2 铜抗性检测
• 2.3 PCR扩增验证
• 2.4 AHAS酶活
• 2.5 转化子的遗传稳定性分析
• 3 小试实验结果
• 3.1 SOD酶活性与乙偶姻含量的测定
• 3.2 CO2减重实验
• 3.3 受体菌和工程菌生物量的比较
• 3.4 其他发酵指标的比较
• 四 结果与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章列表