粘质沙雷氏菌产过氧化氢酶的研究

论文摘要

过氧化氢酶（catalase, CAT, EC1.11.1.6）是一类普遍存在于各种动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,其功能是催化细胞内过氧化氢分解,防止膜脂过氧化;其广泛应用于食品、造纸、纺织等领域。因此,研究筛选过氧化氢酶产生菌、研究其产酶发酵和酶学性质具有理论意义和潜在的应用价值。论文首先从多份土样和种子样品中筛选出9株产过氧化氢酶的细菌,在常规条件下比较了这9株菌产过氧化氢酶情况,分别研究了其过氧化氢酶粗酶性质,分别测得其最适温度,最适pH;通过综合比较选取其中9号菌株作为目标菌株,对9号菌进行形态学分析,生理生化特征测定,脂肪酸组成分析鉴定和16S rRNA基因序列比对,最终将该菌定名为Serratia marcescens SYBCT02。对菌株Serratia marcescens SYBCT02产过氧化氢酶的条件进行了优化,得到其发酵产酶的适宜培养基组成（g/L）为:柠檬酸20,葡萄糖5,玉米浆粉20,pH 7.0,培养温度为33°C;使菌株过氧化氢酶酶活达到9662.22 U/mL发酵液,比优化前（162.03 U/mL发酵液）提高了约60倍。经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析三步纯化得到了菌株Serratia marcescens SYBCT02过氧化氢酶CAT1和CAT2;其中CAT1的比活力为52565.14 U/mg,纯化倍数为71.52,回收率为32.15%, CAT2的比活力为62108.23 U/mg,纯化倍数为84.51,回收率为32.78%。研究了CAT1和CAT2的酶学特性。其中CAT1的最适温度为40°C,该酶的温度稳定性较好,50°C以下保温30 min和60 min,残余酶活仍在80%以上;最适反应pH为6.0,该酶在pH 7-pH 10范围内是比较稳定,当pH低于6的时候酶活力将受到比较大的影响;表观Km值为42.17 mmol/L,Vmax值为57472 U/mg,全波长扫描在280 nm和405 nm附近有吸收峰;不显示过氧化物酶活性;同源四聚体构型,亚基分子量为51 KDa。根据以上结果,将CAT2归属为单功能过氧化氢酶亚群。CAT2的最适温度为50°C,该酶在50°C以下保温30 min和60 min,残余酶活仍在80%以上;最适反应pH为8.0,该酶在pH 9左右最稳定,过酸或者过碱的时候酶活力都将受到比较大的影响;表观Km值为38.17 mmol/L,Vmax值为64103 U/mg;全波长扫描在280 nm和405 nm附近有吸收峰;不显示过氧化物酶活性;同源六聚体构型,亚基分子量为34 KDa。根据以上结果,将CAT2归属为单功能过氧化氢酶亚群。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 过氧化氢酶及其催化的反应
• 1.1.2 CAT 的来源及分类
• 1.1.3 CAT 的结构特点和功能
• 1.1.4 CAT 的应用现状
• 1.2 CAT 的研究进展
• 1.2.1 CAT 的分离纯化
• 1.2.2 CAT 活性的测定
• 1.2.3 过氧化氢酶性质的研究
• 1.2.4 极端 CAT 的研究
• 1.2.5 锰 CAT 模拟
• 1.3 立题依据与研究意义
• 1.3.1 不同来源过氧化氢酶的性质比较
• 1.3.2 生产菌株的选择依据
• 1.4 主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 化学试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株筛选
• 2.2.2 培养方法
• 2.2.3 形态学鉴定部分生理生化鉴定
• 2.2.4 部分生理生化鉴定
• 2.2.5 16S rRNA 的PCR 扩增和序列分析
• 2.2.6 发酵培养基组成单因素试验
• 2.2.7 过氧化氢酶的提取与纯化方法
• 2.2.8 过氧化氢酶活力测定方法
• 2.2.9 生物量测定方法
• 2.2.10 过氧化氢酶性质的研究
• 2.2.11 数据分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 产过氧化氢酶沙雷氏菌的筛选和鉴定
• 3.1.1 菌种筛选
• 3.1.2 菌株的形态学和生理生化特征
• 3.1.3 菌株的脂肪酸组成
• 3.1.4 产胞内过氧化氢酶菌株基于16S rRNA 序列的系统发育分析
• 3.2 Serratia marcescens SYBCT02 摇瓶发酵条件的优化
• 3.2.1 Serratia marcescens SYBCT02 种子生长曲线
• 3.2.2 碳源对Serratia marcescens SYBCT02 产酶的影响
• 3.2.3 氮源对Serratia marcescens SYBCT02 产酶的影响
• 3.2.4 培养基初始pH 对Serratia marcescens SYBCT02 产酶的影响
• 3.2.5 装液量对Serratia marcescens SYBCT02 产酶的影响
• 3.2.6 接种量对Serratia marcescens SYBCT02 产酶的影响
• 3.2.7 发酵温度对Serratia marcescens SYBCT02 产酶的影响
• 3.2.8 比较优化前后Serratia marcescens SYBCT02 产CAT 摇瓶发酵曲线
• 3.3 Serratia marcescens SYBCT02 过氧化氢酶的分离纯化及酶学性质
• 3.3.1 硫酸铵分级沉淀
• 3.3.2 DEAE-纤维素离子交换层析
• 3.3.3 凝胶过滤层析
• 3.3.4 过氧化氢酶纯化结果分析
• 3.3.5 电泳结果验证
• 3.3.6 温度对过氧化氢酶的影响
• 3.3.7 温度对过氧化氢酶稳定性的影响
• 3.3.8 pH 对过氧化氢酶的影响
• 3.3.9 pH 对过氧化氢酶稳定性的影响
• 3.3.10 Serratia marcescens SYBCT02 过氧化氢酶的反应动力学参数
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 菌株SYBCT02 的脂肪酸组成
• 附录2 作者在攻读硕士学位期间发表的论文