肝净注射液指纹图谱研究

论文摘要

肝净注射液由茵陈、栀子、板蓝根、胆汁膏、大黄、黄芩六味药材制得,将药材混合后首先水蒸汽蒸馏提取挥发油,之后进行水煮醇沉,回收乙醇并用1%活性碳处理,灌封、灭菌即得。中药化学成分的多样性与复杂性是其发挥疗效的物质基础,而传统的中药材质量评价方法大多以单一或少数几个成分做指标进行质量评价,不能全面反映其质量情况。中药指纹图谱正是运用现代分析技术对中药化学信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述的中药质量分析的一种新方法。它通过反映中药内在化学成分的种类和数量,提供全面的、综合的信息以控制中药材及中药制剂的质量,是目前国际上能认可的、较好地反映了中药材及中药制剂质量的质量控制方法。因此,建立肝净注射液的指纹图谱对全面控制肝净注射液的质量是十分必要的。目的:建立肝净注射液的HPLC-UV指纹图谱,获得对照图谱,为全面控制肝净注射液的质量提供新的依据。方法:（1）提取:比较不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件。（2）色谱条件:选用合适的色谱柱及检测波长,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究要求。（3）系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中黄芩苷峰的分离度和理论板数。（4）专属性试验:精密吸取阴性溶液、供试品溶液及对照品溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录130min内的色谱图。（5）精密度试验:取同一份供试品溶液,重复进样5次,比较所得指纹图谱的相似度。（6）重复性试验:取同一批肝净注射液6份,平行制备供试品溶液,进样,比较所得指纹图谱的相似度。（7）稳定性试验:取供试品溶液分别于0,2.5,5,7.5,12,24h进样,比较所得指纹图谱的相似度。（8）指纹图谱的建立:分别取肝净注射液5批,制备供试品溶液,进行指纹图谱分析。结果:（1）提取:取肝净注射液1支,用0.45μm滤膜滤过后作供试液。（2）色谱条件:色谱柱:Shimadzu（Shim-pack VP-ODS）柱（4.6mm×150mm,5μm）;柱温:25±0.15℃;流速:1ml/min;检测波长254nm;进样量:10μl。（3）系统适用性试验:按黄芩苷峰计算理论板数约为150000,与其它色谱峰的分离度大于1.5。（4）专属性试验:空白溶剂（甲醇）对测定无干扰,黄芩苷对照峰与供试品溶液图谱的26号峰（71.98min）相对应。（5）精密度试验:相似度均高于0.98,符合指纹图谱测定要求,精密度良好。（6）重复性试验:相似度均高于0.96,符合指纹图谱测定要求,重复性良好。（7）稳定性试验:相似度均高于0.98,符合指纹图谱测定要求,稳定性良好。（8）指纹图谱的建立:得到肝净注射液的指纹图谱。（9）数据分析:利用2004A版相似度软件进行分析,相似度在0.9～1.00为正品肝净注射液,品质较优。结论:本文首次建立了肝净注射液的指纹图谱,得到其对照图谱,利用相似度分析对不同批次肝净注射液间的差异进行了研究,对肝净注射液的质量进行了综合评价,方法重复性和精密度良好,能简便快速地鉴别和区分伪品,有助于肝净注射液的标准化生产和质量控制。大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。其性味苦,寒。归脾、胃、大肠、肝、心包经。泻热通肠,凉血解毒,逐瘀通经。用于实热便秘,积滞腹痛,泻痢不爽,湿热黄疸,血热吐衄,目赤,咽肿,肠痈腹痛,痈肿疔疮,瘀血经闭,跌扑损伤,外治水火烫伤;上消化道出血。酒大黄善清上焦血分热毒。用于目赤咽肿,齿龈肿痛。熟大黄泻下力缓,泻火解毒。用于火毒疮疡。大黄炭凉血化瘀止血。用于血热有瘀出血症。大黄的干燥根根茎中含大量蒽醌衍生物,现代药理研究表明大黄酸（rhein）,芦荟大黄素（aloe-emodin）,大黄素（emodin）,大黄素甲醚（physcion）,大黄酚（chrysophanol）为其主要活性成分。目的:建立肝净注射液中大黄的薄层色谱鉴别项,为科学评价与有效控制肝净注射液质量提供新方法。方法:（1）提取:比较了不同提取方法不同的提取溶剂的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件。（2）色谱条件:选用合适的薄层色谱板和检视方法,调整展开剂的组成、配比,使色谱图符合薄层色谱研究的要求。（3）专属性试验:分别将阴性溶液、供试品溶液及对照品溶液各5μl点于薄层板进行展开。结果:（1）提取:最佳提取条件为精密吸取注射液15ml,加HCl2ml,氯仿10ml,水浴加热回流1小时,放冷,移至分液漏斗,氯仿5ml洗三角瓶,取水层,再加氯仿15ml萃取2次,合并,低温蒸干,甲醇1ml溶解。（2）色谱条件:薄层板选用以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G板;展开剂:石油醚（3060℃）-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1 ）上层;检视方法:晾干后置365nm下观察;点样量:对照品与供试品均为5μl。（3）专属性试验:阴性溶液对测定无干扰,大黄对照药材的主斑点与供试品溶液图谱的主斑点相对应。结论:本文建立了肝净注射液中大黄的薄层鉴别方法,能简便、快速地对肝净注射液中大黄进行鉴别,有助于肝净注射液的标准化生产及质量控制。胆汁膏为猪科动物猪Sus scrofa domestica Brisson.胆汁的浓缩品。其性味苦,寒。归肝、胆、肺、大肠经。猪胆汁中主要成分为胆汁酸类,胆色素、粘蛋白、脂类及无机物等。胆汁酸中有鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholic acid）、3a-羟基- 6-氧- 5α-胆烷酸（3α- hydroxy-6- oxo-5α-cholanic acid）和石胆酸（llthocholic acid）,它们几乎完全与甘氨酸结合而存在。另含猪胆酸（hyocholic acid）,猪去氧胆酸（hyodeoxycholic acid）,3β,6α-二羟基胆烷酸（3β,6α-dihydroxycholanic acid）。具有清热,润燥,解毒,止咳平喘的功效。用于热病燥渴,目赤,喉痹,黄疸,百日咳,哮喘,泄泻,痢疾,便秘,痈疮肿毒。目的:建立肝净注射液中胆汁膏的薄层鉴别方法,为全面控制肝净注射液的质量提供新的依据。方法:（1）提取:比较了不同提取方法、提取溶剂的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件。（2）色谱条件:选用合适的薄层色谱板和检视方法,调整展开剂的组成、配比,使色谱图符合薄层色谱研究的要求。（3）专属性试验:分别将阴性溶液、供试品溶液及对照品溶液各5μl点于薄层板进行展开。结果:（1）提取:取2ml注射液,加入2ml 40%NaOH装入气相小瓶封盖后置于120℃烘箱加热2小时,放冷,调pH至2-3,摇匀,离心,上清液用乙酸乙酯振摇提取3次,每次20ml,,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣用乙醇2ml溶解。（2）色谱条件:薄层板选用以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G板;展开剂:异辛烷—乙醚—冰醋酸—正丁醇—水（10:5:5:3:1）的上层溶液;点样量:对照品与供试品均为5μl。（3）专属性试验:阴性溶液对测定无干扰,供试品溶液图谱的斑点与胆酸和猪取氧胆酸对照品的斑点相对应。结论:本文建立了肝净注射液中胆汁膏的薄层鉴别方法,能简便、快速地对肝净注射液中胆汁膏进行鉴别,有助于肝净注射液的标准化生产及质量控制。绿原酸（chlorogenic acid,CA ）是一种多酚类化合物,由一分子咖啡酸和一分子奎尼酸缩合脱水而成,是植物界广泛存在的一类次生物质,绿原酸用途广泛,研究表明,绿原酸具有抗菌活性。目的:建立肝净注射液中绿原酸的含量测定方法,为有效地控制肝净注射液中茵陈的质量提供新的依据。方法:（1）色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相,流速,调节柱温,使色谱图符合液相色谱研究的要求。（2）专属性试验:精密吸取对照品溶液3μl、供试品溶液及阴性溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录20min色谱图。（3）系统适应性试验:在已确定的色谱条件下,考察图谱中绿原酸的分离度（4）线性试验:取绿原酸对照品溶液,分别进样1μl,2μl,5μl,10μl,25μl,测定峰面积,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。（5）重复性试验:取同一批肝净注射液5份,平行制备供试品溶液,进样,记录保留时间和峰面积。（6）稳定性试验:取供试品溶液分别于0,2,4, 12,24 h进样,记录保留时间和峰面积。（7）范围:制备最高限和最低限浓度的供试品溶液各3份;进样测定,记录保留时间和峰面积。（8）加样回收率试验结果:（1）色谱条件:色谱柱:SHISEIDO ODS柱（4.6mm×150mm,5μm）;柱温:25?C;流速:1.0ml/min;流动相:乙腈-0.1%磷酸（10∶90）;检测波长:327nm。（2）:专属性试验:分别精密吸取绿原酸对照品溶液3μl、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μl,在以确定的色谱条件下进样测定,供试品色谱中在与绿原酸对照品色谱峰保留时间一致处有相应的色谱峰,阴性对照色谱在绿原酸峰保留时间一致处无色谱峰。（3）系统适应性试验:按绿原酸峰计算理论板数约为6700,绿原酸与相邻杂质峰的分离度为2.65 （ > 1.5）,达到良好分离。（4）线性试验:取绿原酸对照品溶液,分别进样1μl,2μl,5μl,10μl,25μl,测定峰面积,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果回归方程为:Y=3485730.91X +7622.40,r=0.9999,表明绿原酸在0.0899～2.2475μg范围内与呈良好的线性关系。（5）重复性试验:取同一批样品,制备供试品溶液6份,进样测定,结果平均含量为0.2708 mg·ml-1,RSD为1.87%（n=6）,表明该方法重复性良好。（6）稳定性试验:精密吸取同一份供试品溶液,分别在1h,2h,4h,12h,24h进样测定峰面积,结果RSD%=0.28%（n=5）,表明样品在24h内稳定。（7）范围:制备最高限和最低限浓度的供试品溶液各3份;进样测定,结果平均含量为0.2689mg·ml-1,RSD为1.07%。（8）加样回收率试验:绿原酸平均回收率为99.24%,RSD%为1.87%（n=6）。结论:本文建立了测定肝净注射液中绿原酸含量的高效液相色谱方法,方法重复性和精密度良好,有助于肝净注射液的标准化生产和质量控制。黄芩苷（Baicalin）为唇形科植物黄芩Suutellaria baicalensis.Georgi的干燥根提取分离出来的一种黄酮类化合物,具有显著的生物活性,具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用,并且具有较强的抗癌反应等生理效能。具有泻实火,除湿热,止血,安胎。治壮热烦渴,肺热咳嗽,湿热泻痢,黄疸,热淋,吐、衄、崩、漏,目赤肿痛,胎动不安,痈肿疔疮。目的:建立肝净注射液中黄芩苷的含量测定方法,为有效地控制肝净注射液中茵陈的质量提供新的依据。方法:（1）色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相,流速,调节柱温,使色谱图符合液相色谱研究的要求。（2）专属性试验:精密吸取对照品溶液3μl、供试品溶液及阴性溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录20min色谱图。（3）系统适应性试验:在已确定的色谱条件下,考察图谱中黄芩苷的分离度。（4）线性试验:取黄芩苷对照品溶液,分别进样1μl,2μl,5μl,10μl,25μl,测定峰面积,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。（5）重复性试验:取同一批肝净注射液5份,平行制备供试品溶液,进样,记录保留时间和峰面积。（6）稳定性试验:取供试品溶液分别于0,2,4,12,24 h进样,记录保留时间和峰面积。（7）范围:制备最高限和最低限浓度的供试品溶液各3份;进样测定,记录保留时间和峰面积。（8）加样回收率试验。结果:（1）色谱条件:色谱柱:SHISEIDO ODS柱（4.6 mm×150 mm,5μm）;柱温:25?C;流速:1.0ml/min;流动相:甲醇-0.1%磷酸（45∶55）;检测波长:276nm。（2）:专属性试验:分别精密吸取黄芩苷对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μl,在以确定的色谱条件下进样测定,供试品色谱中在与黄芩苷对照品色谱峰保留时间一致处有相应的色谱峰,阴性对照色谱在黄芩苷峰保留时间一致处无色谱峰。（3）系统适应性试验:按黄芩苷峰计算理论板数约为4600,黄芩苷与相邻峰的分离度为8.14（ > 1.5）,达到良好分离。（4）线性试验:取黄芩苷对照品溶液,分别进样1μl,2μl,5μl,10μl,25μl,测定峰面积,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果回归方程为:Y=1.003 2 X +6.855 7,r=0.999 9,表明绿原酸在0.104 3～2.607 5μg范围内与呈良好的线性关系。（5）重复性试验:取同一批样品,制备供试品溶液6份,进样测定,结果平均含量为1.883mg·ml-1,RSD为0.99%（n=6）,表明该方法重复性良好。（6）稳定性试验:精密吸取同一份供试品溶液,分别在1h,2h,4h,12h,24h进样测定峰面积,结果RSD%=0.78%（n=5）,表明样品在24h内稳定。（7）范围:制备最高限和最低限浓度的供试品溶液各3份;进样测定,结果平均含量为1.771mg·ml-1,RSD为1.5%。（8）加样回收率试验:黄芩苷平均回收率为98.72%,RSD%为1.05%（n=6）。结论:本文建立了测定肝净注射液中黄芩苷含量的高效液相色谱方法,方法重复性和精密度良好,有助于肝净注射液的标准化生产和质量控制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 肝净注射液指纹图谱研究
• 引言
• 第一部分 肝净注射液指纹图谱研究
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 肝净注射液质量标准的研究
• 一、大黄薄层鉴别研究
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 参考文献
• 二、胆汁膏薄层鉴别研究
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 参考文献
• 三、肝净注射液中绿原酸含量测定的研究
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 四、肝净注射液中黄芩苷含量测定的研究
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述 中药指纹图谱研究现状概述
• 致谢
• 个人简历