尼罗罗非鱼及斑马鱼胚胎细胞分离培养的研究

论文摘要

鱼类细胞的培养研究进展十分迅速。目前,鱼类细胞培养技术已成为一种重要的研究手段,广泛应用于遗传学、病毒学、毒理学、细胞生物学、基因组学以及资源保护等方面。罗非鱼是我国重要的养殖鱼类,斑马鱼是目前最常用的模型动物之一,在国内,有关罗非鱼及斑马鱼胚胎细胞体外培养的研究报道较少。本试验以罗非鱼和斑马鱼为研究对象,分离获得胚胎细胞及胚胎干细胞,探讨体外分离培养尼罗罗非鱼和斑马鱼胚胎细胞及斑马鱼类胚胎干细胞的方法,为利用鱼类胚胎细胞进行药物、饲料安全性评价,研究鱼类生长发育繁殖规律及病害防治技术,提供实验材料。本研究包含三方面内容。1.罗非鱼胚胎细胞分离与培养。从发育至体节分化期尼罗罗非鱼手工分离出胚胎,采用胰蛋白酶消化法对尼罗罗非鱼ECs进行原代和继代分离培养。在5%CO2浓度、28℃及饱和湿度条件下,研究L-15、M199、MEM、DMEM四种细胞培养基对ECs生长增殖的影响。分别在细胞培养基中添加5%、10%、15%、20%及25%新生牛血清（new bovine serum,NBS）培养ECs,比较不同浓度NBS对ECs体外增殖的影响。比较18℃、28℃及37℃培养温度对ECs体外生长增殖的影响。以完全培养液为对照组,探讨不添加尼罗罗非鱼血清、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子（bFGF）及胰岛素时,培养液对ECs体外增殖的影响。结果表明采用DMEM培养基培养,ECs生长增殖最快;在培养液中添加15% NBS,ECs生长增殖最快。当培养温度为28℃时,ECs生长正常,增殖较快;温度降至18℃时,细胞增殖缓慢;温度升至37℃时,细胞仅存活46d。在细胞培养液中添加尼罗罗非鱼血清、β-巯基乙醇、bFGF及胰岛素更有利于尼罗罗非鱼ECs增殖。2.斑马鱼胚胎细胞分离与培养。采用胰蛋白酶消化法从原肠期斑马鱼分离出ECs,并进行原代和继代培养。分别在无CO2和5% CO2浓度、温度28℃、饱和湿度条件下,采用DMEM、L-15、LDF培养基培养ECs,研究不同CO2浓度及三种培养液对ECs体外增殖的影响。在5%CO2浓度、温度28℃、饱和湿度条件下,用含5%、10%、15%、20%及25% NBS的培养液培养ECs,探讨不同NBS浓度对ECs增殖的影响。以完全培养液为对照组,研究不添加尼罗罗非鱼血清、β-巯基乙醇、bFGF及胰岛素四种添加物时,培养液对ECs增殖的影响。结果显示,斑马鱼ECs较适宜在5%CO2、温度28℃及饱和湿度的培养条件下生长。采用添加15%NBS的DMEM培养液培养,ECs增殖最快。除了尼罗罗非鱼血清以外,其它三种添加物均有利于斑马鱼ECs增殖。3.斑马鱼胚胎干细胞分离与培养。从发育至囊胚期斑马鱼手工分离出胚胎,分别采用机械法和胰蛋白酶消化法对斑马鱼ESCs-like进行原代和继代分离,以斑马鱼成纤维细胞为饲养层培养斑马鱼ESCs-like,并对分离培养的斑马鱼ESCs-like进行形态学观察、核型分析、碱性磷酸酶染色及体外分化鉴定。结果表明采用机械法和胰蛋白酶消化法分离原代ESCs-like,获得的斑马鱼ESCs-like集落数无明显差异。机械法更有利于继代分离培养斑马鱼ESCs-like,最高传至3代。培养获得的斑马鱼ESCs-like碱性磷酸酶染色为阳性。对第三代ESCs-like进行核型分析,100个分裂相中有87个分裂相为2n=50条染色体,为正常二倍体细胞。体外无分化抑制培养时,ESCs-like分化为神经样细胞、成纤维样细胞、上皮细胞、黑色素细胞。证明该斑马鱼ESCs-like具有典型的干细胞特征。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 鱼类胚胎细胞的分离培养的研究进展
• 1.1 鱼类细胞培养的概念
• 1.2 鱼类细胞培养组织来源
• 1.3 鱼类胚胎细胞培养的研究
• 1.4 影响鱼类胚胎细胞分离培养的因素
• 1.4.1 温度
• 1.4.2 培养基
• 1.4.3 消化液
• 1.4.4 血清
• 1.4.5 渗透压
• 1.4.6 pH
• 1.4.7 添加物
• 1.5 鱼类胚胎细胞研究的意义
• 1.5.1 遗传学
• 1.5.2 毒理学
• 1.5.3 病毒学
• 1.5.4 资源保护
• 1.5.5 鱼类细胞融合技术
• 2 鱼类胚胎干细胞分离培养技术的研究进展
• 2.1 鱼类胚胎干细胞分离与培养的概念及过程
• 2.2 几种鱼类胚胎干细胞分离培养
• 2.3 影响鱼类胚胎干细胞培养的几种因素
• 2.4 鱼类胚胎干细胞的特性和鉴定鉴定
• 2.4.1 形态学鉴定
• 2.4.2 核型分析
• 2.4.3 全能或多能型性标志检测
• 2.4.4 端粒酶活性
• 2.4.5 体外分化能力的鉴定
• 2.4.6 嵌合体试验
• 2.5 前景与展望
• 2.6 本试验的目的和意义
• 3 罗非鱼胚胎细胞分离和培养
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 试验材料与主要试剂
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.2.3 主要试剂的配制
• 3.2.4 罗非鱼胚胎细胞的原代分离方法
• 3.2.5 罗非鱼胚胎细胞原代和继代培养方法
• 3.2.6 培养基对罗非鱼胚胎细胞的体外培养影响试验设计
• 3.2.7 血清对罗非鱼胚胎细胞的体外培养影响试验设计
• 3.2.8 温度对罗非鱼胚胎细胞的体外培养影响试验设计
• 3.2.9 添加物对罗非鱼胚胎细胞的体外培养影响试验设计
• 3.2.10 核型分析方法
• 3.2.11 数据统计方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 胚龄对分离原代罗非鱼胚胎细胞的影响
• 3.3.2 罗非鱼胚胎细胞原代和继代培养的生长行为
• 3.3.3 培养基对罗非鱼胚胎细胞体外增殖的影响
• 3.3.4 血清对罗非鱼胚胎细胞体外增殖的影响
• 3.3.5 温度对罗非鱼胚胎细胞体外增殖的影响
• 3.3.6 添加物对罗非鱼胚胎细胞体外增殖的影响
• 3.3.7 罗非鱼胚胎细胞核型分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 胚龄对罗非鱼胚胎细胞原代培养影响机制的探讨
• 3.4.2 培养基对罗非鱼胚胎细胞增殖影响机制的探讨
• 3.4.3 血清对罗非鱼胚胎细胞增殖影响机制的探讨
• 3.4.4 温度对罗非鱼胚胎细胞增殖影响机制的探讨
• 3.4.5 不同添加物对罗非鱼胚胎细胞增殖影响机制的探讨
• 3.5 小结
• 4 斑马鱼胚胎细胞分离培养
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 试验材料与主要试剂
• 4.2.2 主要仪器设备
• 4.2.3 主要试剂的配制
• 4.2.4 斑马鱼胚胎细胞原代和继代培养
• 4.2.5 培养基对体外培养斑马鱼胚胎细胞的影响试验设计
• 4.2.6 血清浓度对体外培养斑马鱼胚胎细胞影响试验设计
• 4.2.7 添加物对体外培养罗非鱼胚胎细胞影响试验设计
• 4.2.8 数据统计
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 斑马鱼胚胎细胞原代和继代培养的生长行为
• 4.3.2 培养基对斑马鱼胚胎细胞体外增殖的影响
• 4.3.3 血清对斑马鱼胚胎细胞体外增殖的影响
• 4.3.4 添加物对斑马鱼胚胎细胞体外增殖的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 培养基对斑马鱼胚胎细胞增殖影响机制的探讨
• 4.4.2 血清对斑马鱼胚胎细胞增殖影响机制的探讨
• 4.4.3 不同添加物对斑马鱼胚胎细胞增殖影响机制的探讨
• 4.5 小结
• 5 斑马鱼类胚胎干细胞分离培养
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 试验材料与主要试剂
• 5.2.2 主要仪器设备
• 5.2.3 主要试剂的配制方法
• 5.2.4 斑马鱼胚胎成纤维样细胞的体外培养方法
• 5.2.5 饲养层的制备方法
• 5.2.6 斑马鱼类胚胎干细胞的分离和体外培养方法
• 5.2.7 斑马鱼类胚胎干细胞的鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 分离方法对斑马鱼类ES 细胞分离培养的影响
• 5.3.2 斑马鱼类胚胎干细胞的鉴定
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介