论文摘要
1.缺血后处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用在大多数肝脏外科疾患的手术过程（例如严重的肝外伤、肝叶切除、肝移植等）中,缺血再灌注损伤是一个普遍存在的病理现象。尽管随着器官保存、外科手术技术、围手术期处理水平和免疫抑制剂的不断改进和提高,肝移植已成为众多慢性、进行性、不可逆性肝病的有效治疗方法;但肝移植术后可能出现的肝功能衰竭、移植排斥反应、胆道狭窄、血栓等并发症始终困扰着医务工作者。特别是肝移植过程中不可避免的缺血再灌注损伤是导致早期移植肝功能不良（poor early graft function,PEGF）或原发性无功能（primary nonfunction,PNF）的重要原因,因此,研究者们不遗余力地去研究潜在的相关机制并探索各种可能的保护性方法。缺血再灌注损伤的病理生理学机制十分复杂且具体过程并未明了,但可以确定的是多种作用机制参与其中,包括炎性细胞因子的合成和释放,中性粒细胞的聚集与浸润,氧自由基的释放,能量代谢的障碍、钙平衡障碍等。缺血预处理对缺血再灌注损伤所起的保护作用已在多种器官和动物模型乃至临床上得到了证明。但由于大多数供肝来源于脑死亡供体,其在肝移植上的应用有很大的局限性。研究发现,缺血后处理具有和预处理相似作用,能够减轻缺血再灌注损伤所造成的心室纤颤、减少心肌梗死面积。在本研究中,我们通过建立同品系大鼠肝移植模型,研究缺血后处理对移植肝缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其作用机制。目的:建立同品系大鼠肝移植动物模型,研究缺血后处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制,并观察不同后处理循环次数对作用效果的影响,以期为减轻肝移植后缺血再灌注损伤提供新的方法。方法:健康雄性Spraque-Dawley大鼠,体重280-320g,随机分为4组,（1）假手术组（sham operated group/SO,n=6）:仅行开关腹手术;（2）缺血再灌注损伤组（ischemia reperfusion group/IR,n=6）:以“二袖套”法行肝移植术;（3）后处理1组（ischemic postconditioning 1 group /IPostC1,n=6）:手术方法同IR组,但在门静脉完全再通前,以无损伤小动脉夹给予门静脉30s再通-30s阻断,共循环3次;（4）后处理2组（ischemic postconditioning 2 group /IPostC2,n=6）:处理方法同IPostC1组,但将供肝植入后门静脉完全再通前的复灌复停循环次数增至6次。再灌注后6小时,各组受体经下腔静脉抽血并留取肝脏,血样离心后取部分上清用全自动生化分析仪检测ALT、AST及LDH;部分上清置于-20℃冰箱保存,待测TNF-α水平;称取2g肝组织4℃下以匀浆器研磨为10%的组织匀浆,-20℃冰箱保存待测GSH-PX、MDA、MPO、SOD、NO含量;取各组肝中叶组织以4%多聚甲醛固定24h,常规石腊包埋,连续5um切片,HE染色后利用HPIAS-100图像分析系统分析损伤坏死区域比例。结果:（1）供体手术时间30.1±3.26min,供肝准备时间17.3±2.14min,受体手术时间46.4±3.60min,无肝期18.5±1.62min,手术总成功率达到75%,手术失败的主要原因为吻合口出血、吻合口狭窄及血栓形成;（2）与SO组相比,IR组的ALT、AST和LDH均明显升高,而两后处理组ALT、AST和LDH水平较IR组明显降低,后处理组间无显著差异;（3）IR组肝组织MDA含量较SO组迅速增高而SOD和GSH-PX活力显著降低;IPostC1与IPostC2组MDA含量显著下降,而抗氧化酶活力显著提高,两后处理组间未见显著差异;（4）IR组MPO水平显著增高,IPostC1与IPostC2组肝内MPO水平显著下降,两后处理组间无显著差异;（5）与SO组相比,IR组血清TNF-α水平显著增高;IPostC1和IPostC2组血清TNF-α水平较IR组明显下降,两后处理组间无显著差异;（6）与SO组相比,IR组血清NO含量升高,两后处理组与IR组相比,NO含量进一步升高,两后处理组间无显著差异;（7）光镜下发现IR组肝组织切片中可见肝窦间隙紊乱,肝细胞坏死,中性粒细胞浸润以及出血,后处理各组小叶结构保存良好,有少量出血和中性粒细胞浸润,与IR组相比,肝组织损伤坏死面积明显减少。结论:（1）以改良“二袖套”法成功建立了大鼠原位肝移植动物模型,并与“三袖套”法进行了比较,证明前者手术时间略长但成功率高,后者手术时间短但成功率低;（2）缺血后处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤具有明显的保护作用;（3）缺血后处理可能通过增强NO合成和减轻中性粒细胞激活浸润程度发挥其保护性作用;（4）简单的增加循环次数并不能增强缺血后处理的保护性效果;（5）该方法实施简单可行,有一定的临床应用价值。2.沉默树突状细胞CD40基因以诱导免疫耐受的体外实验研究移植排斥反应始终是困扰组织器官移植的一大难题,应用免疫抑制药物并不能有效地控制排斥反应,且受者术后需长期服药。但免疫抑制剂均有其毒副作用,长期使用会降低受者全身免疫功能,从而增加发生机会性感染和肿瘤的危险。最理想的解决方法是诱导受体对供体组织器官的免疫耐受。树突状细胞（Dendritic cell,DC）是目前已知的功能最强的专职抗原呈递细胞（APC）,能够激活幼稚T细胞（Naive T cells）、启动初次免疫应答,调节免疫激活和免疫耐受的平衡,在免疫应答过程中发挥重要作用。CD40是CD40L的受体,广泛表达于多种细胞（DC、B细胞、巨噬细胞和内皮细胞等）表面。在免疫应答过程中,T细胞的功能性活化需要两类信号协同作用才能完成,DC除了为T细胞提供MHC-抗原复合物（第一信号）以外,成熟DC表达高水平B7-1、B7-2和CD40共刺激分子,为T细胞活化提供协同刺激信号（第二信号）。CD28-B7和CD40-CD40L均能独立提供第二信号,但CD40-CD40L的结合为更为早期的分子事件,它的结合可以上调CD28、B7分子的表达,从而促进CD28-B7的结合。RNA干涉（RNA interference,RNAi）是近年发展起来的基因特异性沉默技术,其本质是一种广泛存在于高等植物和动物中的由双链RNA介导的转录后基因沉寂（post transcriptional gene silencing, PTGS）现象。与反义技术、核酶技术以及抗体介导的基因表达沉默技术相比,RNAi具有高效、特异等优点,目前已广泛应用于基因功能和基因治疗等研究中。本研究拟利用RNAi技术特异性沉默大鼠骨髓源性DC的CD40表达,观察转染后DC的表型及其刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的变化,为将RNAi应用于“耐受性DC”的制备和组织器官移植免疫耐受的诱导提供新的思路。目的:建立体外诱导、扩增大鼠骨髓来源树突状细胞的方法,并观察其表型及功能特性;利用高效的pSilencer 4.1-CMV neo Vector构建针对大鼠CD40的小干扰RNA真核表达载体,观察转染骨髓来源DC后对其细胞表型及免疫功能的影响。方法:利用Ambion公司的网上设计工具,设计2个靶向CD40基因的发夹状siRNA,通过化学合成的方法合成2对分别互补的寡核苷酸链,退火后将双链DNA片段连接至pSilencer4.1-CMV neo vector的多克隆位点,转化扩增提取质粒,对重组质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定。取得大鼠骨髓细胞后,去除红细胞,加入重组大鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（rrGM-CSF）、重组大鼠白细胞介素4（rrIL-4）培养2周;在光镜和扫描电镜下观察培养DC的形态学特征,流式细胞仪检测DC表面MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达水平,混合淋巴细胞反应检测其刺激同种T细胞增殖能力。于培养第6天,共分4组进行转染:（1）空转染组:仅加入转染试剂;（2）阴性对照组:阴性对照pSilencer4.1- CMV neo negative control转染组;（3）pS-CD40A转染组;（4）pS-CD40B转染组。经肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor, TNF）-α和脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）继续诱导成熟48h,流式细胞仪检测DC表面分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达情况,逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）及western blot检测沉默效果,免疫荧光检测CD40表达情况,ELISA检测培养上清中IL-10和IL-12水平;混合淋巴细胞反应检测转染前后DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力。结果:（1）经双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与pSilencer4.1-CMV neo vector连接正确,靶向大鼠CD40基因的siRNA重组表达质粒构建成功;（2）细胞培养8天后,经倒置显微镜和电镜观察DC出现典型形态,培养6天的DC具有不成熟表型,流式细胞仪检测MHC-Ⅱ表达为29.1%、CD80为21.9%,CD86为25.2%,刺激同种T细胞增殖能力较低,而培养12天DC的MHC-Ⅱ表达为76.2%、CD80为80.7%,CD86为82.4%,刺激同种T细胞增殖能力明显增强;（3）转染后各组DC表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达结果无明显差异;（4）RT-PCR显示pS-CD40A转染组CD40mRNA条带表达明显减弱,而空转染组、阴性对照组、pS-CD40B组间比较无明显差异;（5）Western-blot结果显示pS-CD40A转染组DC的CD40蛋白表达被明显抑制,而空转染组、阴性对照组、pS-CD40B组间比较无明显差异;（6）pS-CD40A组细胞荧光强度较空转染组、阴性对照组和pS-CD40B组明显减弱;（7）ELISA检测各组DC培养上清IL-10和IL-12细胞因子浓度,结果显示pS-CD40A组IL-10较其他组明显增加,而IL-12水平显著减少;（8）MLR结果显示pS-CD40A组转染后DC的共刺激能力较其余各组明显减弱。结论:（1）成功构建大鼠CD40基因的RNA干扰真核表达载体;（2）成功建立大鼠骨髓来源DC的培养方法,大鼠骨髓干细胞经rrGM-CSF、rrIL-4诱导培养2周后得到具有典型形态特征及功能的DC;（3）pS-CD40A能够有效沉默DC表面CD40表达,转染后DC的IL-12表达水平明显降低,而IL-10表达水平升高,刺激同种T淋巴细胞增殖能力较弱,有望成为新的构建致耐受性DC方法。
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